乳品中抗生素的檢測方法

　　王慶忠 蒲彪

　　（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與工程技術(shù)學(xué)院，四川省雅安市 625014）

　　摘要：本文對檢測抗生素的3種主要方法：微生物法、酶法和色譜法的設(shè)計(jì)原理和篩選策略進(jìn)行了分析。論述了BSDA 、Charm Farm、Charm Cowside、Penzyme、Delvotest P、CITE Probe、Lactam Test Kit等檢測方法的研究歷史。比較和分析了多種方法的檢測敏感性、特異性和影響檢測的可能因素。最后就如何提高我國乳品的抗生素檢測水平，提出了建議措施。

　　關(guān)鍵詞：抗生素 檢測 原理 篩選 BSDA 試劑盒

　　 經(jīng)多年的實(shí)踐，人們認(rèn)識到抗生素可以增強(qiáng)牲畜抗病能力、提高養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)投比。但過量使用，將降低畜牧產(chǎn)品品質(zhì)，影響乳品發(fā)酵。而含有抗生素殘留的動(dòng)物性產(chǎn)品，進(jìn)入人類食物鏈，會使體內(nèi)菌株產(chǎn)生抗生素抗性，擾亂機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，菌群失調(diào)而不利于健康；也會對易感人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)、激素障礙變態(tài)反應(yīng)。因此，F(xiàn)AO及WHO早在1969年就提出應(yīng)規(guī)定各種動(dòng)物性食品中的抗生素殘留允許標(biāo)準(zhǔn)，WHO于1979年規(guī)定原料奶及消毒牛奶中不得有抗生素。近年來，國內(nèi)對奶制品中的抗生素殘留也非常關(guān)注，無抗奶（Antibiotic-Free Milk）的生產(chǎn)和消費(fèi)已成為大勢所趨。但我們對奶制品中抗生素的檢測缺乏必要的研究，檢測技術(shù)還十分落后。本文旨在對抗生素的檢測方法進(jìn)行總結(jié)，為在我國開展相關(guān)工作奠定基礎(chǔ)。

　　1 檢測原理

　　傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法是基于抗生素殘留對微生物生長的抑制，以擴(kuò)散過程或渾濁度為基礎(chǔ)。抗生素濃度越高，微生物的生長受抑制程度越大，菌落越小。STOP法（當(dāng)場棉拭檢驗(yàn)）以枯草芽孢桿菌（ATCC6633）32℃下培養(yǎng)16-18小時(shí)測定抗生素；CAST法（獸崽抗生素和磺胺制劑實(shí)驗(yàn)）則是接種巨大芽孢桿菌（ATCC9885）在44℃下培養(yǎng)；而BSDA法（B.stearothermophilis tablet Disc Assay，嗜熱脂肪芽孢桿菌圓盤檢驗(yàn)法）則采用嗜熱脂肪芽孢桿菌。

　　免疫檢驗(yàn)法是對抗抗生素抗體的檢驗(yàn)?；诳股卮碳?dòng)物產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)急反應(yīng)，從而形成抗體。通過抗原-抗體的特異性結(jié)合，確定抗生素含量。該方法的引申是通過細(xì)胞質(zhì)表皮因子（Surface Plasmon Resonance，SPR）對抗生素的特異結(jié)合，測定相應(yīng)的酶活性或基質(zhì)的電流變化，從而推算抗生素濃度，以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測。

　　使用高效液相色譜（HPLC）和質(zhì)譜（MS）對抗生素進(jìn)行定量、定性的測定，主要是基于它們測定痕量物質(zhì)的優(yōu)越性。

　　Andrew[1]總結(jié)了6家公司8種檢測試劑盒的檢測原理，見表1?？煽闯鲇幸话霗z測試劑盒是采用抑制微生物生長的原理而設(shè)計(jì)的。

　　表1 不同檢測試劑盒工作原理

　　試劑盒 生產(chǎn)廠家 分析原理

　　Charm Farm Charm Science, Inc. (Malden,MA) 抑制微生物生長

　　Charm Cowside Charm Science, Inc. 青霉素競爭性吸附展示

　　Delvotest P Gist-brocade Food Ingredients, Inc. 抑制微生物生長

　　Penzyme SmithKline Beecham Animal Health 酶反應(yīng)

　　CITE Probe ICEXX Laboratories, Inc. 抗原-抗體吸附

　　Lactam Test Kit Idetek, Inc. 競爭性酶聯(lián)免疫

　　Valio T101 Valio Finland, Research and Development Centre 抑制微生物生長

　　Charm BSDA Charm Science, Inc. 抑制微生物生長

　　2 檢測方法篩選策略

　　FDA獸醫(yī)學(xué)中心規(guī)定，檢測方法敏感性要強(qiáng)，特異性要高。某項(xiàng)方法如要成為法定方法，其檢測的最低限值應(yīng)該在95%置信度的情況下，檢測FDA規(guī)定的安全濃度或允許濃度（safe or tolerance level，歐盟稱為MRL，Maximum Residue Limits）可能性要大于90%。可以采取以下策略篩選和評價(jià)檢測方法[2]：

　　第一步，初步評價(jià)敏感性和特異性。測定特異性時(shí)，選擇絕對不含抗生素的樣品，其中體細(xì)胞數(shù)量（Somatic Cell Count，SCC）要<106/ml，結(jié)果為陰性。測定敏感性時(shí)，則在奶樣中添加MRL水平的抗生素，結(jié)果為陽性。

　　第二步，測定最底檢測限。使用30-60個(gè)樣本，其中的抗生素含量一般間于20%MRL到2倍MRL水平，繪制檢測方法對不同抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　第三步，評價(jià)影響因素。采用含有內(nèi)毒素，且SCC含量間于2×106-6×106個(gè)/ml的奶樣，特異性要達(dá)到90%以上。

　　第四步，現(xiàn)場檢驗(yàn)。各種類型（地區(qū)、牧場規(guī)模、抗生素類型）的奶樣的廣泛檢測，檢測結(jié)果同HPLC對照。

　　由此，F(xiàn)DA在M-a-85備忘錄中將Charm BSDA等15種方法規(guī)定為法定檢測方法（見表5）。

　　3 幾種典型的檢測方法

　　按照檢測原理和使用的儀器，抗生素的檢測方法可分三類：酶法、微生物法和色譜法。

　　3.1 微生物法

　　3.1.1 BSDA法

　　最常用的是BSDA法，采用嗜熱脂肪芽孢桿菌對抗生素的耐受程度作為檢測指標(biāo)。Kang-KH[3]分別采用嗜熱脂肪芽孢桿菌、藤黃鏈球菌（Micrococcus luteus ）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus ）等3種細(xì)菌檢測抗生素，它們對青霉素的檢測低限分別為0.0025 U/ml、0.01 U/ml和0.03 U/ml。

　　Ueta[4]用紙圓盤法檢測抗生素，76個(gè)無抗生素的奶樣中有48個(gè)為抗生素陽性，而使用TTC和Delvotest P檢測卻為陰性。

　　3.1.2 試劑盒法

　　Delvotest P試劑盒是依據(jù)嗜熱脂肪芽胞桿菌的生長對培養(yǎng)基顏色的改變?yōu)闇y試指標(biāo)，黃色為陰性，紫色為陽性(青霉素檢出限度為0.003 U/mL)[5]。

　　TTC(氯化三苯基四氮唑法)同樣依據(jù)顯色狀態(tài)判斷結(jié)果，未顯色者為陽性，微紅色者為可疑；桃紅色或紅色者為陰性。其檢測低限見表2。

　　表2檢測各種抗生素的檢測底限

　　抗生素名稱 最低撿出量（U/ml）

　　青霉素 0.004

　　鏈霉素 0.5

　　慶大霉素 0.4

　　卡拉霉素 5

　　3.1.3 試管改進(jìn)法

　　Stadhouders[6]電泳法檢測抗生素。奶樣經(jīng)丙酮和HCl提取，瓊脂凝膠電泳，后經(jīng)嗜熱脂肪芽孢桿菌55℃下3-3.5h，或蠟狀芽孢桿菌變種（B. cereus subsp. mycoides ）30℃下18-24h，生物顯影，測定抗生素濃度。

　　Nouws-JFM[7]用改進(jìn)試管法檢測四環(huán)素、嘧啶、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、利福霉素、三甲氧芐二氨嘧啶和氨基糖苷類抗生素，檢測菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌，檢測低限在歐盟MRL之下。

　　Shitandi[8]用荷蘭試管擴(kuò)散法檢測抗生素，與BSDA法比較，多管法可提高準(zhǔn)確度。

　　3.2 酶免疫法

　　Bleile-DM[9]采用高特異性的單克隆和多克隆抗體檢測β-內(nèi)酰胺抗生素，僅需8分鐘，對青霉素-G和先鋒霉素Ⅳ的檢測低限分別為5 ng/ml、10 ng/ml。

　　Jackman[10]采用競爭性ELISA檢測青霉素-G，分析內(nèi)可變性（intra-assay variation）為5.3%，分析外可變性（interassay variation）為5.4% ，均符合規(guī)定。

　　Weber[11]使用Fluorophos BetaScreen 4p test 和 FLM200 fluorometer檢測脫脂乳、酪乳、UHT奶和巧克力奶中的青霉素-G、氨芐青霉素、阿莫西林、鄰氯青霉素和催產(chǎn)素, 檢測低限在MRL附近，特異性間于 94%-100%。

　　Kumar[12]使用固相熒光免疫法測定β-內(nèi)酰胺抗生素 (青霉素-G、氨芐青霉素、阿莫西林、 鄰氯青霉素和先鋒霉素Ⅳ)。熒光物質(zhì)采用Cy-55，固相為SiO2毛細(xì)管，檢測時(shí)間<3分鐘，檢測底限達(dá)ppb水平。

　　Zhi-ZL等[13]使用一種自動(dòng)流體免疫檢測系統(tǒng)檢測先鋒霉素Ⅳ，檢測底限為1ug/l，回收率為97.3%。

　　3.3 生物傳感器法

　　Gaudin[14]采用BLACORE檢測磺胺二甲基嘧啶（SMZ）。即將SPR上的改性羧甲基葡聚糖金屬結(jié)合傳感器為檢測因子，檢測SMZ。SMZ在0-200 ug/kg之間，兩者存在線形關(guān)系；檢測時(shí)間8-30分鐘；檢測底限達(dá)到1.7ug/kg。并行多孔檢測，可同時(shí)檢測青霉素、四環(huán)素、氯霉素和氨基糖苷類抗生素。

　　Setford[15]將能特異吸附青霉素-G的蛋白質(zhì)固定在基質(zhì)上，青霉素-G同蛋白質(zhì)結(jié)合，引起電流的變化，從而推算其濃度。本方法時(shí)間短，靈敏、試劑少，很適合野外操作。

　　Gustavsson[16]用SPR上具羧肽酶活性的蛋白質(zhì)為檢測因子，β-內(nèi)酰胺抗生素的含量同它的活性之間存在線形關(guān)系。本方法可解決ELISA流量小，微生物法只測活性成分的缺點(diǎn)，并能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)檢測。對青霉素-G的最小檢測限為2.6 ug/kg，3日檢測變動(dòng)率間于7.3%-16%。

　　3.4 HPLC

　　Dasenbrock[17]采用HPLC-IPAD （Integrated Pulsed Amperometric Detection，脈沖電流檢測）測定氨芐青霉素和先鋒霉素Ⅳ，快速、簡便。先鋒霉素Ⅳ濃度為40、20和10 ppb 時(shí)，提取率分別為74%、80%和77%。而氨芐青霉素濃度為20、10和5ppb時(shí)，提取率為67%、78%和75%。

　　4 檢測方法比較

　　很多學(xué)者研究了不同檢測方法的敏感性、特異性和使用便捷性。

　　Macaulay[18]采用5種檢測方法：(i) Charm test; (ii) Delvotest P; (iii) Bacillus subtilis在乳清瓊脂上的生長; (iv) Bacillus subtilisas抗生素基質(zhì)上的生長; (v) Difco測定青霉素、紅霉素和四環(huán)素。結(jié)果見表3，iv、v兩法更為靈敏。

　　表3 不同測定方法對抗生素的檢測低限

　　檢測方法 青霉素(U/ml) 紅霉素(mg/ml) 四環(huán)素(mg/ml)

　　i 0.025 — —

　　ii 0.025 6.75 20

　　iii 0.05 6.75 20

　　iv 0.05 1.68 20

　　v 0.05 1.68 20

　　Senyk[19]采用Angenics Spot Test, Charm II, Delvotest P, Penzyme Farm and Penzyme Lab III等5種快速檢測法，對10種抗生素：青霉素-G、先鋒霉素Ⅳ、鏈霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、氯霉素、紅霉素、新新霉素、四環(huán)素和慶大霉素進(jìn)行檢測。通過對5個(gè)濃度，8個(gè)樣品的測定，同BSDA法相比，各檢測方法都達(dá)到法規(guī)的要求。

　　Carlsson[20]研究Arla microtest、Valio T101、Delvotest SP和Charm II 4種方法。經(jīng)氣相色譜證實(shí)，當(dāng)自由脂肪酸(FFA)濃度達(dá)到 4-5mM時(shí)，Arla microtest和Valio T101對四環(huán)素和大環(huán)內(nèi)酯抗生素的測定可能出現(xiàn)假陽性，而Delvotest SP 和CharmII則不會。

　　Eenennaam[21]通過5種檢測方法對172頭奶牛樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，Charm Farm、CITE R probe、Delvotest-P、BSDA、LacTek等5種方法的假陽性率從高到低依次為為81.7%、43.6%、37.7%、18.8%和2.6%。影響結(jié)果的最大因素為SCC。5種方法的敏感性、檢測性和特異性見表4。

　　表4 5種檢測方法的敏感性、檢測性和特異性（%）

　　檢測方法 敏感性 檢測性 特異性

　　CITE probe (beta-lactam) 85 72 30

　　Delvotest-P 97 82 38

　　Charm Farm 100 100 9

　　LacTek 93 93 99

　　BSDA 97 96 61

　　Hozova-B[22]的研究表明BSDA、INTEST和 DelvotestP 等3種方法在檢測青霉素、氯霉素、四環(huán)素和鏈霉素時(shí)，各方法之間的重合性較好，符合EU和IDF檢測MRL的要求。

　　Zeng-SS[23]使用Delvotest P、Penzyme 和BSDA檢測羊奶中的抗生素。表明：檢測青霉素-G和先鋒霉素Ⅳ，Delvotest P存在7%的假陽性率；Penzyme無假陽性，后者更為敏感、特異和快速。

　　Andrew[1]研究了Delvotest P、 Charm Cowside、Charm Farm、 Penzyme、Valio T101、LacTek、CITE Probe、Charm Bacillus stearothermophilus disk assay等方法，認(rèn)為除CITE Probe法以外，其它方法的正確率達(dá)到90%以上。

　　Gardner[2]研究了FDA規(guī)定的15種檢測方法，認(rèn)為不同方法對不同抗生素檢測低限不一樣；檢測特定的青霉素需要相應(yīng)方法。從表5可以看出對青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、青霉素Ⅳ的檢測，除Lactam Test Kit CFF法以外，其它方法都可完成；能檢測頭孢霉素的有Charm II Competitive、Charm Farm等11種方法；但可檢測對鄰氯青霉素的只余下Charm II Tablet Quantitative、Lactam Test Kit B-L等3種方法。

　　表5 各種方法的檢測低限（ppb）

　　檢測方法 青霉素 氨芐青霉素 阿莫西林 鄰氯青霉素 青霉素Ⅳ 頭孢霉素

　　允許或安全濃度 5 10 10 10 20 50

　　Charm II Competitive 4.8 9.0 10.0 70.0 4.5 25.0

　　Charm Farm 5.0 10.0 10.0 40.0 20.0 25.0

　　Charm II Tablet Sequential 4.8 8.0 10.0 50.0 4.5 23.0

　　Charm II Tablet Transit 4.8 9.0 10.0 80.0 4.5 13.0

　　Charm Rapid Inhibition 3.0 4.5 4.5 25.0 16.0 50.0

　　Charm II /Cowside Tablet 4.8 4.0 10.0 50.0 8.0 40.0

　　Charm II Tablet Quantitative 4.8 8.0 10.0 10.0 4.5 23.0

　　Charm BSDA 5.0 6.5 10.0 48.0 11.0 75.0

　　Delvotest Test P 3. 4.0 8.0 30.0 8.0 50.0

　　Delvo-X-Press 5.0 4.0 10.0 50.0 10.0 10.0

　　Lactam Test Kit B-L 5.0 8.0 10.0 5.0 16.0 未檢測

　　Lactam Test Kit CFF 未檢測 未檢測 未檢測 未檢測 未檢測 50.0

　　Penzyme III 5.0 4.0 8.0 80.0 8.0 80.0

　　Penzyme Milk 5.0 4.0 8.0 80.0 8.0 80.0

　　Snap Test 5.0 4.0 10.0 50.0 8.0 50.0

　　5 影響因素

　　由于乳制品組分的多樣性，各種抗生素在動(dòng)物體內(nèi)代謝的復(fù)雜性，以及各檢測方法的不同檢測原理，會影響檢測結(jié)果。最常見的就是假陽性和假陰性問題。

　　Okada[24]的研究表明在SCC濃度低的情況下，有10.2%的假陽性率；而當(dāng)SCC濃度>3×106/ml時(shí), 假陽性率增加到19.7%。

　　Carlsson[25] Delvotest P的假陽性率上升同動(dòng)物體內(nèi)的自然抗生素的濃度呈線形關(guān)系。這些自然抗生素主要是乳鐵蛋白（lactoferrin）和溶菌酶（lysozyme）。

　　Cullor[26]在美國乳品生產(chǎn)聯(lián)盟和美國獸醫(yī)協(xié)會的合作的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)的檢測方法假陽性率太高，需進(jìn)一步改進(jìn)。

　　Angelidis[27]在研究Delvo-X-Press對β-內(nèi)酰胺的測定時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)奶樣中的乳鐵蛋白（bovine lactoferrin）>1 mg/ml時(shí),可導(dǎo)致假陽性; SCC也可導(dǎo)致相同結(jié)果。當(dāng)SCC>106/ml時(shí)，與假陽性呈線形關(guān)系（r = 0.61，P<0.01）。

　　Suzanne[28]認(rèn)為用BSDA檢測抗生素，實(shí)驗(yàn)時(shí)的瓊脂層厚度、菌株菌齡、加樣技術(shù)和樣品中的內(nèi)含物都可能影響測定結(jié)果。而采用TTC法，時(shí)間長，肉眼辨別，易產(chǎn)生誤差。

　　為了控制假陽性或假陰性，Gardner[2]建議采用至少兩種檢測方法，第一種為便宜的高敏感性的方法；第二種為高特異性（>99%）的以確證結(jié)果。

　　6 結(jié)語

　　我國關(guān)于奶制品中抗生素檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)方法最早出現(xiàn)在《牛乳檢驗(yàn)方法——GB5409—85》中，采用TTC法。1994年制訂的《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)　鮮乳中抗生素殘留量檢驗(yàn)——GB/T 4789.27—1994》，也采用TTC法。2001年9月，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《無公害食品生鮮牛乳》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，檢測方法同《GB5409—85》，并不得檢出?！毒G色食品消毒牛乳標(biāo)準(zhǔn)》也做了類似規(guī)定。可看出，我國還未將抗生素納入常規(guī)檢測，作為必檢項(xiàng)目；所采用的TTC法精確性和時(shí)效性都比較差。

　　展望新世紀(jì)的乳制品工業(yè)，為了保障人體健康，適應(yīng)WTO的要求，增強(qiáng)國內(nèi)乳制品業(yè)的國際競爭力，必須將抗生素的檢測納入議事日程。

　　首先是要制定相應(yīng)的法規(guī)和檢測程序，將乳制品中抗生素的檢測、報(bào)告、處罰和管理等納入法制化軌道，適應(yīng)市場經(jīng)濟(jì)就是法制經(jīng)濟(jì)的要求。

　　其次是要修訂、制訂乳制品標(biāo)準(zhǔn)，將抗生素的檢測納入國標(biāo)體系。解決國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)混亂，與國際標(biāo)準(zhǔn)沖突的問題，加大采用國際標(biāo)準(zhǔn)的比例，同國際標(biāo)準(zhǔn)接軌。

　　再次是要進(jìn)行抗生素檢測方法篩選工作，提高國產(chǎn)試劑盒的研制能力。努力研究發(fā)展一些簡單、快速、經(jīng)濟(jì)和便攜化的能檢測多種抗生素殘留的分析技術(shù)；發(fā)展高效、高靈敏的聯(lián)用技術(shù)和多殘留組分確證技術(shù)。

　　相信通過以上措施將提高我國乳制品抗生素檢測水平，為該行業(yè)的健康發(fā)展提供有力的保障。