安定(Diazepam)系國家控制的精神藥品,具有抗焦慮、鎮靜、催眠等藥理活性。在動物飼養和運輸過程中使用,可降低動物的維持需要,減少途中失重和死亡率。某些不法者受到利益驅使常在飼料中添加使用,在動物組織中殘留而導致畜產品不安全,因此我國農業部嚴令禁止安定用于飼料。目前國內還沒有對飼料中安定的檢測方法,建立對飼料中安定的快速、準確、可靠的測定方法,打擊違法使用安定已迫在眉睫。我們應用高效液相色譜法分析飼料中的安定,采用液-液分配結合固相濃縮、凈化,外標法定量,具有回收率、靈敏度高和穩定性好等特點。 1 材料與方法 1.1 儀器 島津LC-6A、SPD-6A紫外檢測器、C-R3A數據處理器、CL3R離心機、LAB4000旋轉蒸發器、SCQ-l00超聲波儀、Supelco固相萃取裝置、固相萃取柱(Florisil,3mL/200mg) 1.2 試劑和藥物 1.2.1 試劑 二氯甲烷、正己烷、醋酸銨、無水碳酸鈉(AR)、乙腈(HPLC淋劑),所用溶液均為重蒸水配制。 1.2.2 安定 含量99.50%,光譜檢測合格,司法部司法鑒定科學技術研究所提供。工作液制備:20.0mg安定溶于甲醇中,定容至100mL,制定200μg/mL貯備液,再依次用甲醇稀液制成2.0,1.0,0.50,0.25,0.10,0.05μg/mL的工作液。 1.3 試驗方法 1.3.1 色譜條件 色譜柱CLC-ODS(250×4.6mm,5μm);流動相:25mmol/L醋酸銨:乙腈=50:50(V/V);檢測波長254nm;柱溫40℃;流1.0mL/min;進樣量20μL。 1.3.2 標準曲線繪制 以濃度由小到大的次序,分別進樣0.05,0.10,0.25,0.50,1.00,2.00μg/mL的工作液,按上述色譜條件用HPLC儀檢測,得到色譜圖,根據峰面積倍比關系及保留時間確定樣品峰。 1.3.3 樣品預處理 稱取5.0g飼料加入30mL蒸餾水,用10%碳酸鈉溶液調節pH=10。用30mL正己烷一二氯甲烷(5:3V/V)分兩次萃取,取有機相15mL,過Florisil小柱,用3mL二氯甲烷洗柱,最后用甲醇1mL洗脫,收集洗脫液,供HPLC分析。 1.3.4 樣品回收率及精密度測定 取空白飼料5.0g,定量加入安定對照品,制成O.5,1.0,2.0μg/g三個濃度,按樣品制備方法處理后,HPLC檢測。 1.3.5 檢測限測定 將安定對照品分別加入空白飼料中,使每克飼料含安定O.002,0.005,0.010,0.020,0.050μg,按樣品制備方法處理后,HPLC檢測,觀察出現安定色譜峰的飼料藥物濃度。 2 結果 2.1 標準曲線 各濃度的安定工作液在選定的色譜條件下用HPLC測定,得到標準曲線回歸方程: Y=49095.22X+648.86; 相關系數r=0.9999 其中:Y代表峰面積; X代表安定工作液濃度(μg/mL)。 2.2 色譜圖 在本試驗選定的色譜條件下,將安定工作液用HPLC測定,測得安定的保留時間約為12.5min,色譜峰峰形較佳(圖略)。 2.3 樣品回收率 見表1。 2.4 檢測限在本試驗的色譜條件下,信噪比為3時,安定的最低檢測濃度為0.01μg/g。 3 討論 3.1 生物樣品中安定的提取方法通常采用液一液萃取、固相萃取及固相微萃取,考慮到飼料樣品組分的復雜性,本試驗采用液一液萃取結合固相萃取方法,實現提取、凈化和濃縮三重目的。液一液萃取考察了正己烷與二氯甲烷不同配比對提取率和干擾情況的影響,以5:3時提取率較高,且易實現有機相和無機相的良好分層。安定在酸性、中性水溶液中不穩定,因此本試驗確定在pHlO下提取。為了進一步消除干擾物質,本試驗比較了氧化鋁小柱和Florisil小柱對提取液濃縮、凈化的效果,結果Folridil小柱凈化效果較好。表1安定回收率測定結果添加濃度(μg/g) 實測濃度(μg/g) 回收率(%) 變異系數(%) 0.50 0.47±0.013 87.40±2.62 3.00 1.00 0.880±0.024 88.00±2.42 2.75 2.00 1.818±0.058 90.90±2.88 3.17 3.2 文獻報道HPLC測定安定常用甲醇與水溶液作為流動相,本試驗作了比較研究,發現用乙腈與水溶液作為流動相分離更好,本試驗以25mmol/L醋酸銨作為水相,分離效果獲得很好改善。 3.3 本方法為檢測飼料中安定提供了一種準確、快速、方便和經濟的測試手段,有利于飼料中藥物和違禁藥品監測工作的開展。