關鍵詞：內源氨基酸；排泄量；測定方法
氨基酸的消化率是評定單胃動物飼料蛋白質營養價值的重要參數。在氨基酸的消化率中，回腸末端真消化率因其有更好的可加性（Nyachoti等，1997）、合理性和準確性而被廣泛采用，而要測定回腸末端真消化率，就必需正確評估動物的內源性氨基酸的排泄量。目前，內源性氨基酸的測定方法主要有以下幾種。
1.內源氨基酸測定的傳統方法
內源氨基酸測定的這幾種方法都不能與原料的測定同時進行，因此也有人稱之為“非生理狀態測定法”，且把用此法測出的內源氨基酸含量稱為“最低內源氨基酸損失量“（Vincent Hess等，1997）。
1.1無氮日糧法（proteinfree diet ）
無氮日糧法是測定飼料氨基酸真消化率最經典的方法，它是由Mitchell在1924建立的。其假定條件是動物采食無氮日糧后，進入食糜或糞中的蛋白質、氨基酸即為內源性的，并且在日糧組成不同的條件下，動物內源性氨基酸的排泄量和氨基酸組成是相同或相似。然而事實是并非如此。low(1979)指出,飼喂無氮日糧可能改變動物的代謝而影響內源氮的損失量。Ozimek等（1985）發現，動物采食無氮日糧后，胰腺分泌的消化酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶減少，腸道分泌的蛋白總量也減少。研究還發現，無氮日糧不僅改變了動物的內源氮損失量，也使內源氨基酸的組成發生了變化，大大增加了了內源脯氨酸和甘氨酸的損失（De Lange，1989)。這是因為，動物采食無氮日糧時，由于動物體維持正常生命活動和生產活動所需的蛋白質無法從無氮日糧中攝取，于是動用肌肉組織釋放大量氨基酸，其中以谷氨酰胺最多，谷氨酰胺又代謝成谷氨酸、脯氨酸等，因此豬采食無氮日糧時，食糜中脯氨酸含量增加，而且隨著無氮日糧中纖維素水平的升高，回腸末端食糜中甘氨酸和脯氨酸的量顯著增加（de Lange 等，1989；Leterme等，1992； Mariscal-Landin等，1995），這是由于日糧中的纖維素刺激了唾液和膽汁分泌的結果（Low,1982），唾液和膽汁分泌的糖蛋白中含有較多的甘氨酸和脯氨酸。
無氮日糧法簡便，易操作，成本低，至盡仍在廣泛采用。但用該方法測定內源氮時，動物處于非正常生理狀態（low,1980），影響動物體蛋白質的正常的代謝(Millward等，1976)，減少含氮物質向消化道的分泌。Butts等（1992）和Donkoh等（1995）研究表明，無氮日糧因缺乏蛋白質類對消化道的刺激，會低估回腸末端內源性氨基酸的含量。此外，日糧成分中的纖維、抗營養因子等可能提高內源性氨基酸的排泄量（Ikegami,1990;Liener和Kakade,1980），而無氮日糧中因缺乏這類物質的刺激，也會導致測定結果偏低。因此，一般認為無氮日糧低估了豬的內源性氨基酸的排泄量（Butts等，1993； Donkoh和Moughan,1999）。
1.2回歸外延法
為了克服無氮日糧的缺陷，Carlson等（1970）發明了一種回歸外延法，用以估測內源性氨基酸的排泄量。其方法是，測定豬飼喂不同蛋白質水平的日糧時糞中或食糜中的蛋白質或氨基酸量，然后用數理統計的方法，外推出日糧蛋白質水平為零時，糞或食糜中蛋白質或氨基酸的量， 即為內源性蛋白質或氨基酸的損失量。Fan等（1995）認為該法對內源氮的損失的估計比無氮日糧法有更高的準確性，因為這種方法考慮了不同品質的蛋白質和抗營養因子等對內源氮和氨基酸排出的影響（souffrant,1991;Fan等，1995）。然而，大量的研究表明，回歸外延法與無氮日糧法并沒有什么差異（Taverner等,1981;Furuya 和 Kaji,1989;Donkoh等,1995）。該方法雖然考慮了日糧蛋白質含量對內源性氨基酸排泄量的影響，但與無氮日糧法一樣，在計算飼料氨基酸真消化率時，仍然存在不同的飼料都扣除同量內源性氨基酸。而且，Souffrant(1991)研究發現，蛋白質采食量與內源性氨基酸排泄量不存在線性關系，而且飼料蛋白水平的增加總是與其它營養物質成分的改變相聯系，因此，影響了對結果進行準確的估測。
1.3完全可消化蛋白源法或靜脈灌注平衡氨基酸法
為避免無氮日糧對動物造成的非生理狀態對測定造成的不利影響，Leibholz(1982)給生長豬飼喂以完全消化的酪蛋白為唯一氮源的日糧估測內源氨基酸排泄量，結果發現，內源氮的排泄量與無氮日糧的測定值沒有顯著差異（分別為3.4和3.0g/kgDMI）。然而Fuller和Cadenhead(1991)向無氮日糧中添加酪氨酸和合成氨基酸，結果表明，采食酪氨酸和合成氨基酸日糧的豬的內源氮的損失低于采食無氮日糧豬的內源氮損失（分別為4.3和5.8g/d）。后者的研究結果與Lange等（1989）的研究結果一致。這說明，處于正氮平衡狀態下豬的內源性氨基酸的損失量稍低于處于負氮平衡下內源氨基酸的損失量。Leterme等（1994）比較了無氮日糧、可消化酪蛋白法和靜脈灌注平衡氨基酸法對回腸內氨基酸損失的影響，結果表明，靜脈灌注平衡氨基酸法測得的內源氨基酸損失（除脯氨酸、胱氨酸和蛋氨酸外）與無氮日糧法沒有明顯差異。因為氨基酸并不能起到蛋白質或多肽刺激消化酶分泌的作用，但由于靜脈灌注氨基酸可以消除負氮平衡導致的體組織分解，因而可減少尿氮損失。
該法前提條件是，酪氨酸或平衡氨基酸在消化道內被完全吸收。而事實上，日糧中的粗纖維水平（Bergner等，1994）和抗營養因子含量（Huisman等，1992）都可能影響其吸收，而只有當酪氨酸或平衡氨基酸的的真消化率經試驗證明達到100%時，該方法在實際應用中才能得到可靠的結果。
2.同位素標記法
同位素標記技術是直接測定豬采食含蛋白質日糧時內源氮損失的一種方法。一般用15N 或13C對飼料蛋白或動物體氨基酸庫進行標記。
2.115N同位素標記法
15N同位素標記技術可區分內源氮和非消化氮，而且可用于測定日糧成分變化對內源氮和氨基酸損失的影響，被認為是直接測定豬采食含蛋白質日糧時內源氮損失的一種最有效的方法（Souffrant等，1986）。15N同位素標記技術可通過兩種途徑進行，一是對飼料蛋白質進行標記（Leterme等，1994；Roos等，1994），二是對動物的氨基酸庫（de Lange,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）即內源性氨基酸進行標記，其中以后者最為常用。此法的根本假定是，當15N在體內各部位達到恒態后，回腸末端內源氮中15N同血漿游離AA（血液氮前體池三氯乙酸溶解物）中15N相同。其基本操作為，持續往動物血液中灌注標記的氨基酸，標記內源氮的前體池，當15N標記物在血液氮前體池三氯乙酸（TCA）溶解物中達到穩定后，根據血液氮前體池三氯乙酸（TCA）溶解物中15N富集度同回腸末端食糜中15N之比即可推算出食糜中內源氮占總氮的比例（de Lang,1989;Huisman等，1992；Schulze等，1994）。
在應用15N稀釋技術時，被標記的含氮物的選擇、15N 標記物在血液中的穩態的確定（15N富集度穩態的判斷）和內源氮前體庫的選擇（Moughan等，1992）都直接影響內源氮估計的準確性。由于亮氨酸是很穩定的氨基酸，除蛋白質合成外沒有其他重要的代謝功能（Grala等，1998），因此，15N-亮氨酸被普遍選作標記物；而回腸食糜內源15N的富集度與血清三氯乙酸（TCA）可溶部分中15N的富集度相似（Grala等，1998），因此可以以15N在血清TCA可溶部分中的穩定狀態作為15N標記物的穩定態。但腸道氨基酸的再循環是十分迅速的，在血清總氮TCA可溶部分中，15N的富集存在晝夜變化。因此，人們對血清TCA可溶部分是否存在著15N富集的穩定態存在著質疑。然而，Alpers(1972)研究表明，被吸收氨基酸可不進入血液，而直接被腸細胞用于蛋白質的合成，所以，血清三氯乙酸可溶部分中15N的富集度可能低估了內源氨基酸的排出量。
除此之外，用15N測定氨基酸的真消化率還存在很多問題。如，該法僅能直接測出一種氨基酸的消化率，而其他氨基酸的消化率是在假設其它氨基酸與此氨基酸的內源損失之間存在恒定的關系式而估計出來的，這一方法的可行性尚有疑問（Lien等,1993）；該方法的另一個問題是前體庫中并非所有的含氮物是完全標記的（de Leng等,1992）。且該法費用昂貴，在實際應用中受到很大的限制。
1. 213C 標記法
13C標記法的原理是利用植物中自然富集的13C作為標記。已知大氣中二氧化碳約含有1.1%同位素13C和98.9%的12C。在光合作用時，植物是排斥13C的(O`Leary,1981)。但植物通過二羧途徑（C4途徑）固定二氧化碳時，比通過Calvin（C3途徑）循環對13C的排斥程度低（Minson等，1975）。玉米、高粱、甘蔗是C4植物，而小麥、大麥和大豆是C3植物。而動物在利用日糧氨基酸合成體蛋白時并不排斥13C（Minson,1975）。因此，用13C富集程度不同的日糧飼喂動物時，若能相應產生不同程度的標記，且在多種組織的標記率不同，利用同位素比率質譜儀就可用于測定13C的自然富集，從而對內源氮和氨基酸損失進行估計，測定不同日糧中的蛋白質和氨基酸的真消化率（Arentson等,1995）。Arentson等（1995）用13C作為標記，用小腸氨基酸組分13C的富集程度作為內源蛋白質標記的指數把回腸蛋白質區分為內源和未消化蛋白質兩部分，測定了不同日糧的真氨基酸消化率。結果表明，13C標記方法可用于測定氨基酸的內源損失，但這種方法仍有與15N-相同的缺點，即標記物再循環，動物氮庫的標記方法及代表內源氮分泌的組織選擇問題，但因為13C在飼料中是自然富集的，并不需要另行標記，因此13C方法比標記15N的費用要低得多，但仍需用昂貴的同位素比質譜計。
2. 高精氨酸法
高精氨酸技術是由Hagemeister 和Erbesdobler(1985)首先提出的。原理是在一定條件下，通過甲基異脲（Methylisourea）與日糧賴氨酸發生胍基化反應將日糧賴氨酸轉化為高精氨酸。當高精氨酸被動物體吸收后，在肝臟中精氨酸酶的作用下，又被重新轉變為賴氨酸，同時釋放出尿素。高精氨酸被機體吸收后不能用于蛋白質合成（不構成內源氮），因此吸收后的高精氨酸不會重新出現在腸道中，回腸食糜中存在的高精氨酸應該全部是外源性的，即為飼料中未被消化道吸收的外源蛋白質，其數量代表了未被消化的外源蛋白質的量（Souffrant,1991;Schmitz等,1991）。高精氨酸技術應用的前提條件有：（1）待測日糧蛋白中賴氨酸的胍基化反應必須完全（至少保證日糧中絕大數的賴氨酸都能轉化為高精氨酸）；（2）胍基化反應不會影響動物對日糧蛋白質的消化吸收；（3）高精氨酸不在腸道中水解為賴氨酸和尿素；（4）高精氨酸同其它氨基酸一樣進行吸收代謝；（5）高精氨酸不會重新出現在腸道中；（6）血液或腸道內的高精氨酸不會影響內源氮的損失（Drescher等,1994;Marty等,1994）。
大量的研究證明，高精氨酸技術可用于直接測定內源賴氨酸和日糧賴氨酸真消化率（Rutherfurd 和Moughan,1990;Schmitz 等，1991；Marty等,1994）。但用此方法測定熱損壞蛋白質的賴氨酸真消化率和內源賴氨酸損失時，須給予特別注意。因為只有當高精氨酸在待測飼料蛋白質中均勻分布時，樣品才具有代表性，否則影響測定結果（Schulze 等，1994）。如果飼料蛋白質中的賴氨酸側鏈被封閉，特別是經Maillard反應后被封閉，賴氨酸的側鏈就不能與甲基異脲反應而轉化高精氨酸，造成飼料蛋白質標記不完全，不具有代表性。在這種情況下，待測飼料高精氨酸的消化率只代表了未被熱損害的部分蛋白質，而非整個待測飼料蛋白質的消化率，從而導致對內源賴氨酸損失及待測飼料賴氨酸真消化率的估測不準確（Schulze等，1994）。
由于日糧賴氨酸胍基化反應的充分與否隨日糧蛋白質來源的不同而有所差異，這就限制了該法的應用（Maga,1981;Rutherfurd and Moughan,1990;de Vrese 等,1994），所以該方法更適用于日糧的蛋白質來源只有一種時的情況。而在實際生產中，日糧蛋白質是多種蛋白源共同組成，所以，能否利用其測定內源氮氨基酸還有待于確定。Nyachoti等（1997）用高精氨酸技術測定不同蛋白質原料對內源賴氨酸排出量的影響時，得出的結果變化范圍為586~1429mg/kgDMI。高精氨酸技術可直接測定的內源賴氨酸的損失情況和日糧賴氨酸的真消化率，而其它氨基酸的內源損失和真消化率則是由假設其它氨基酸與賴氨酸的內源損失之間存在恒定的關系式而估計出來的（de Lange等,1990;Marty等,1994）。因此，應用高精氨酸技術估計賴氨酸之外的其它氨基酸的內源損失和真消化率的準確性還需進一步探討。
4.肽營養超濾技術
Moughan等（1990）及Butts（1991）建立了肽營養超濾法。其技術原理和過程如下：給動物飼喂含酶解酪蛋白（Enzyme hydrolysed casein,EHC）（分子量低于8.25×10-21g）作為唯一蛋白質來源的半純合日糧，然后收集回腸末端食糜，立即通過離心和超濾等方法，將食糜中的大分子蛋白質（分子量大于1.65×10-20g）與小分子蛋白質（分子量小于1.65×10-21g）迅速分離開來，大分子量蛋白質即為內源性，而小分子量蛋白質是飼糧中未被吸收的部分。事實上，分離出的小分子蛋白質不完全是外源的氨基酸和小肽，還包括一小部分內源的氨基酸和小肽。Morghan和Schutter(1991)報道內源氮損失中小分子的游離氨基酸和小肽大約占１１％，而Butts等（１９９２）和 Marty等（１９９４）報道的數據分別為２１％和９.２％。這說明內源氮損失中游離氨基酸和小肽所占比例變異較大，而這部分可能導致低估實際的內源氨基酸的損失。
與無氮日糧相比，肽營養超濾法無疑有利較大的改進，避免了由于日糧蛋白質缺乏而導致的消化性分泌減少，對動物采食平衡日糧時的內源氮損失的估計可能更準確。Butts 等（1991）將該方法成功地運用于生長大鼠的內源性氨基酸排泄的測定，測定結果表明，該方法的測定值高于無氮日糧法，而與15N同位素標記法的結果相當。說明該方法在評估動物的內源性氨基酸排泄上有相當的準確性。但是，肽營養技術的一個主要的不足是該方法沒有考慮日糧因素（如日糧成分和高水平的抗營養因子等）對內源氮損失的影響。此外，肽營養超濾法存在的一個問題是超濾技術本身的問題，超濾技術不適于定量分離，Letermre等（1994）比較了超濾和凝膠過濾兩種分離技術后認為，在分離可溶性組分時兩方法有較大的差異，其中以凝膠過濾法效果較好。Donkoh等（１９９５）指出，肽營養超濾技術適用于日糧蛋白質來源為動物性成分（如骨粉）的內源氮損失的估計。
3. 氨基糖測定法
Fuller等（1991）提出可以用氨基糖作為估測回腸末端內源氮損失的指示物，氨基糖是粘蛋白的組成成分。Seve等（1994）對內源氮及氨基糖隨日糧蛋白質水平和粗纖維含量的變化規律進行的研究發現，氨基葡萄糖與氨基半乳糖的比值不受日糧成分變化的影響，為2.1~2.3，接近于粘蛋白中的比例，這表明到達回腸末端的氨基糖是一個較為穩定的指標。但Seve等（1994）的試驗還表明，隨日糧纖維水平的提高，氨基糖未能表現出與內源氮相似的變化規律。據此，Seve等（1994）指出，氨基糖雖可作為內源氮的指示物，但它反映的更可能是粘蛋白的分泌情況，而非真正的內源氨基酸損失，由此可見，該方法的實際應用還需對氨基糖的分泌和影響因素以及與內源氮分泌規律間的聯系作進一步研究。
4. 體內、體外結合測定法
Boizen和Fernandez提出了這一方法，體外測定部分模擬體內的消化過程，用胃蛋白酶、胰酶溶液對飼料樣品進行處理，根據飼料與消化殘余物間的差值求出蛋白質的體外消化率，再用體內消化法測定出飼料的表觀回腸末端蛋白質消化率，則這兩者的差值就是內源氮的損失部分（Boizen和Fernandez，1994）。其與體外測定部分中的體外未降解干物質間的回歸關系為：
EPL=13.2=0.66×UDM (r2=0.61)
（EPL 內源氮損失 （g/kgDM） UDM 體外未降解干物質（g/kgDM））
該方法簡便、省時、省力。但尚存在一些疑問，如，體外未降解干物質是否為內源蛋白質、氨基酸的適宜指示物；哪些因素影響試驗的結果等。這一方法還需做大量的驗證工作，如能驗證則會有廣闊的應用前景。
結語
隨著內源氨基酸的測定方法的不斷改進，內源氮和氨基酸測定的準確性也大大提高了。但迄今為止，直接測定內源氨基酸的方法尚存在技術上或經濟上的困難，因此，這一領域還有待于進一步深入研究，以便找出一種經濟、簡便、實用的測定內源氨基酸的方法，更準確地評價蛋白質的營養價值，從而為飼料配方提供信息，也為進一步提高飼料蛋白質的利用效率提供理論依據。
