1 主題內容與適用范圍
            　　本標準規定了飼料中維生素B2測定方法。
            　　本標準適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、維生素預混料中維生素B2的測定。待測液中維生素B2檢測濃度為0.05～0.2μg／mL。
            　　2 引用標準
            　　GB 6682 實驗室用水規格
            　　3 方法原理
            　　維生素B2（即核黃素C
            17H20N1O6）在440nm紫外光激發下產生綠色熒光，在一定濃度范圍內其熒光強度與核黃素濃度成正比。用連二亞硫酸鈉還原核黃素成無熒光物質，由還原前后熒光強度之差與內標熒光強度的比值，計算樣品核黃素的含量。
            　　4 試劑和溶液
            　　除特殊規定外，本標準所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或相應純度的水。
            　　4.1 鹽酸溶液，0.1mol／L：將8.5mL鹽酸（GB 622）用水稀釋至1000mL。
            　　4.2 鹽酸溶液，1mol／L。
            　　4.3 氫氧化鈉（GB 629）溶液，1mol／L。
            　　4.4 冰乙酸（GB 676）。
            　　4.5 冰乙酸溶液，0.02mol／L：將1.8mL冰乙酸用水稀釋至1000mL。
            　　4.6 高錳酸鉀（GB 643）溶液，40g／L。
            　　4.7 過氧化氫（HG 3─1082）溶液，100mL／L。現用現配。
            　　4.8 核酸素標準溶液
            　　 4.8.1 核黃素貯備液
            ：核黃素（中國藥典參照標準），于五氧化二磷干燥器中干燥24h，稱取0.0500g，溶解于0.02mol／L
            乙酸溶液（4.5）中，在蒸汽浴上恒速攪動直至溶解，冷卻后稀釋至500mL。盛入棕色瓶滴加甲苯覆蓋，低溫（4℃）保存。該溶液每毫升含0.1mg核黃素。
            　　4.8.2
            核黃素貯備液Ⅱ：取核黃素貯備液Ⅰ（4.8.1）10mL用0.02mol／L乙酸溶液稀釋至100mL，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆蓋，低溫（4℃）保存。該溶液每毫升中含10μg核黃素。
            　　4.8.3 核黃素標準工作液：取核黃素貯備液Ⅱ（4.8. 2） 10mL，用水稀釋至
            100mL。現用現配。該溶液每毫升中含1μg核黃素。
            　　4.9 熒光素標準溶液
            　　4.9.1 熒光素貯備液：稱取熒光素（Q／HG
            22─786）0.0500g，用水稀釋至1000mL，盛于棕色瓶中，低溫（4℃）保存。該溶液每毫升中含50μg熒光素。
            　　4.9.2
            熒光素標準工作液：取熒光素貯備液（4.9.1）1mL，用水定容至1000mL，盛入棕色瓶中，低溫保存。該溶液每毫升中含0.05μg熒光素。
            　　 4.10 溴鉀酚綠pH指示劑：取溴鉀酚綠（HGB
            3386）0.1g，加氫氧化鈉溶液（0.05mol／L）2.8mL使之溶解，再加水稀釋至200mL。變色范圍ph4.6～5.2。
            　　4.11 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）（Q／HG 2─001），防止吸潮。
            　　5 儀器、設備
            　　5.1 熒光分光光度計。
            　　5.2 分析天平：感量0.0001g。
            　　5.3 電熱恒溫水浴。
            　　5.4 具塞玻璃刻度試管，15mL。
            　　6 試樣的制備
            　　采集具有代表性的樣品至少500g，四分法縮減至100g，磨碎，通過0.28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存備用。
            　　7 分析步驟
            　　7.1稱樣：單一飼料、配合飼料、濃縮飼料稱取1～2g，精確至0.001g。維生素預混料稱取0.25～0.50g，精確至0.0001g，將試樣置于100mL容量瓶中。
            　　7.2
            樣液的制備：向盛樣品的容量瓶中加65mL鹽酸溶液（4.1），于沸水浴中加熱30min，開始加熱5～10min時常搖動容量瓶，以防樣品結塊。或于121～123℃
            15磅高壓釜中加熱30min。冷卻至室溫后，用氫氧化鈉溶液（4.3）調節pH至6.0～6.5，然后立即加稀鹽酸溶液（4.2）使pH值約為4.5（溴甲酚綠指示劑變為草綠色）。用水稀釋至刻度。通過中速無灰濾紙過濾，棄去最初5～10mL溶液，收集濾液于100mL
            錐形瓶中。取整份清液，滴加稀鹽酸檢查蛋白質如有沉淀生成，繼續加氫氧化鈉溶液，劇烈振搖，使之沉淀完全稀釋到測量體積。對高含量樣品，取整分的澄清液，用水稀釋至一定體積使含核黃素約為0.1μg／mL（以下操作避免紫外光照射）。
            　　7.3
            雜質氧化：于a、b、c三支15mL刻度試管（5.4）中各吸入樣液（7.2）10mL，同時做平行，向試管a、b、c中各加入1mL蒸餾水，向試管b中加入1mL核黃素工作液（4.8.3）。然后各加入冰乙酸（4.4）1mL，旋搖混勻后逐個加高錳酸鉀溶液（4.6）0.5mL，旋搖混勻，靜置2min，再逐個加入過氧化氫溶液（4.7）0.5mL旋搖，使高錳酸鉀顏色在10s內消退。加蓋搖動，使試管中的氣體逸盡。
            　　7.4
            測定：用熒光素溶液（4.9.2）調整熒光儀，使其穩定于一定數值，作為儀器工作的固定條件。調整激發波長440nm，發射波長525nm，測定試管a、b的滎光強度，樣液在儀器中受激發光照射不超過10s。在試管c中加入20mg連二亞硫酸鈉，搖動溶解，并使試管中的氣體逸出，迅速測定卒熒光強度作為空白。若溶液出現渾濁，不能讀數。
            　　8 分析結果的計算和表述
            　　8.1 計算方法和公式
            　　核黃素（維生素B2）含量以mg／kg（或g／kg）表示，按下式計算：
            　　核黃素（VB2mg／kg）＝〔（A－C）／（B－A）〕×（M／m）×（V／V1）×R
            　　 式中：A──
            　　試管a（樣液加水）的熒光強度；
            　　B──
            　　試管b（樣液加標樣）的熒光強度；
            　　z ──
            　　試管c（樣液加連二亞硫酸鈉）的熒光強度；
            　　m──
            　　加入核黃素標樣的量，μg；
            　　V──
            　　樣液的初始體積，mL；
            　　V1──
            　　 測定時分取樣液的體積，mL；
            　　m──
            　　試樣質量，g。
            　　R──
            　　 稀釋倍數。
            　　A-C／B-A值應在0.66～1.5，否則需調整樣液的濃度。
            　　8.2 平行測定結果用算術平均值表示，保留有效數3位。
            　　9 重復性
            　　同一分析者對同一試樣同時或快速連續進行兩次測定，所得結果之間的差值：
            　　在核黃素含量小于或等于5.0mg／kg時，不得超過平均值的15％。
            　　在核黃素含量大于5.0mg／kg時，不得超過平均值的10％。