摘 要：抗生素在畜牧業中的廣泛應用，不可避免地造成牛奶中殘留抗生素。抗生素殘留不僅危害人類健康，同時也影響牛奶的品質，造成經濟損失。本文綜述牛奶中抗生素殘留的來源和危害、現狀以及殘留的檢測方法。
        關鍵詞：牛奶；抗生素殘留；微生物法；高效液相色譜法；色/質聯用法；免疫法
            　　
          隨著抗生素在乳畜飼養業中的廣泛應用，牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視。對此，檢測技術也迅速發展，以尋求簡便、快速、準確、敏感性高的檢測方法滿足日趨嚴格的殘留限量要求，保障人們飲用牛奶的衛生和安全。
            　　
            1.牛奶中抗生素殘留的來源及其危害
            1.1牛奶中抗生素殘留的來源
            　　 
         一般認為，對泌乳牛用藥不當或不注意安全時間是牛乳中抗生素殘留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素殘留。在牛飼料中添加飼料添加劑已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是預防疾病，這是牛奶抗生素殘留的重要原因。此外，一些不法交奶戶在高溫季節為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，這也是乳中抗生素殘留的一個來源。1983年，Egan調查表明，用經抗生素治療的乳牛用過的擠乳器給正常乳牛擠乳，可使正常牛的乳中殘留抗生素，所以擠乳是乳中抗生素殘留的另一個來源。
         1.2牛奶中抗生素殘留的危害
        牛奶是老少皆宜的營養品，牛奶中若含有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素有過敏體質的人服用殘留抗生素的乳后會發生過敏反應。即使是正常飲用者，體內的某些條件性致病菌易產生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效。抗生素是奶牛場治療乳房炎的常規藥物，由于長期大量使用，使耐藥菌株增加，一些乳房炎病例變得難以用常規方法治愈。這種情況又促使臨診獸醫在治療過程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素殘留會影響奶制品品質，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制細菌的發酵，使產量和質量降低。因此市場不允許出售抗生素殘留過量的牛奶，同時也造成牛奶生產者的經濟損失。
            　　
        2.牛奶中抗生素殘留的現狀
        牛奶中抗生素殘留問題日益受到國際社會的重視。1991年底，美國食品藥物管理局（FDA）報告，在234個鮮乳樣品中只有一個樣品檢出磺胺二甲嘧啶，其殘留量低于10×10－6允許量。1992年上半年又檢查了197個樣品，結果有4個樣品檢出磺胺殘留，但殘留量在安全水平以下，均沒有檢出四環素、氯霉素和青霉素。1990～1991年期間，美國奶業基金會（Milk  Industry Foundation）對牛乳和生產乳制品會員廠進行全面的藥物殘留檢查，抽查率90％以上，結果為：1990年不合格率0.12％，1991年0.8％；并規定超過允許量標準的牛乳及其乳制品全部廢棄處理，不得食用。歐美國家多年前即明文禁止抗生素殘留超量的牛奶上市（對青霉素類藥物的限量為4～10μg/kg）。

        我國過去對牛奶中抗生素殘留衛生指標無明文規定，直到2001年10月，農業部發布實施了《無公害食品生鮮牛乳行業標準》，對新鮮牛乳的衛生指標明確了“抗生素不得檢出”。但對這一行業標準，我國目前并未能嚴格執行，致使我國牛奶及奶制品中抗生素殘留問題一直未能得到解決，以至引起了人們對牛奶安全問題的擔憂，并成為越來越受關注的熱點。 
        1988年，周樹南對江蘇省8市10個牧場的鮮奶、消毒牛奶和奶粉中抗生素殘留情況進行調查，結果發現鮮奶陽性率3.6％，消毒牛奶11.4％，奶粉39.58％。李權超(1991)、王曉光(1992)測得長春市市售鮮牛奶中抗生素殘留陽性率3.3％，可疑率18.3％和2.5％。張利琴(1999)、常建軍(2000)測得西寧市市售鮮奶中抗生素陽性率分別為2％、11.7％和5.3％。 
         葛華等（1996）對西寧市各類奶樣進行調查，共采集奶樣187份（奶牛場生奶110份、牛奶公司袋裝消毒奶35份、私人沿街售奶42份），檢出有抗生素殘留奶8份，陽性率4.3％。王春奕等(1996)檢測的5批25份市售消毒鮮牛奶中抗生素殘留質量分數在1.5×l0－9以上，超過了世界衛生組織(WHO)和聯合國糧農組織(FAO)規定的奶中青霉素含量為0的標準。并認為這可能與飼料中添加的抗生素過量和獸醫臨床大劑量長期使用抗生素有關。馬群飛等(2002)對福建省生牛乳抗生素殘留情況進行調查，結果86件鮮乳樣中共檢出抗生素殘留陽性樣品17件，檢出率19.8％。據此提出福建省乳牛散養農戶生產的生牛乳抗生素殘留陽性率較高，應通過改善飼養條件和加強監測予以控制。
        從以上情況可以看出，我國牛奶中抗生素殘留現狀并不令人樂觀，有關部門應加強對牛奶生產的管理，并對牛奶中的抗生素等藥物殘留進行有效檢測和監控，以保證人們飲用牛奶的衛生和安全。
            　　 
          3.牛奶中的抗生素殘留檢測方法研究進展
          3.1微生物檢測法 
          微生物檢測法是應用較廣泛的方法，其測定原理是根據抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用,來定性或定量確定樣品中抗微生物藥物殘留，如紙片法（PD）、TTC法、拭子法（STOP）等。采用傳統的微生物檢測方法，缺點是：(1)時間長；(2)顯色狀態判斷通過肉眼辨別，易產生誤差，對微紅色者無法做出準確判斷；(3)操作復雜。優點是費用低，一般實驗室都能操作。其中，
            紙片法和TTC法是牛奶中藥物殘留檢測的兩種常用的微生物檢測法。
         3.1.1紙片法
         紙片法，即PD法(Paper Disc)。常用的紙片法有枯草桿菌紙片法和嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法。這兩種方法主要用來檢測牛奶中的β－內酰胺類抗生素，其操作過程基本相同，而選用的菌種不同。枯草桿菌紙片法檢測的結果易出現假陽性，為了確定陽性物質是否為青霉素（或β－內酰胺類），對加熱后的乳樣用青霉素酶處理，以滅活乳樣中的青霉素。然后再行檢測，檢測限可達0.01   IU/mL。而嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法不僅用于檢測奶樣中β－內酰胺類抗生素，并能暗示是否還存在其它抑菌物質，檢測限可達0.008 IU/mL以下。一般在4h內即可獲得結果。因此，在實踐中嗜熱脂肪桿菌紙片法比枯草桿菌紙片法應用更為廣泛。此外，神保勝彥(1991)對紙片法作了進一步研究和改進。改進后的紙片法不僅能夠確定抗生素的種類，而且提高了檢出率和準確性，氯霉素最低檢出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，鏈霉素1mg/kg，紅霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
          3.1.2 TTC法 
          TTC法，即氯化三苯基四氮唑法( tripheye tetrazolium  chloride)，是目前我國食品衛生標準中規定的檢查牛乳中抗生素殘留的檢測方法(GB5409—85)。該法簡便、快速，無需特殊設備，3～4h可見報告，很適合牧場、乳品廠及食品衛生檢測部門采用。檢測各種抗生素所用的TTC法試驗的靈敏度（最低檢出量）分別為：青霉素0.004   U/mL，鏈霉素0.5 U/mL，慶大霉素0.4 U/mL，卡那霉素5 U/mL。
         目前趨向研究更為靈敏、準確、簡便、快速的微生物檢測方法。如美國和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺實驗法（CAST）。此外，美國近年來補充的一個新的實驗方法－快速抗生素篩選法（FAST）。 
       盡管這些快速微生物檢測法有時會產生一些假陽性，但在某種程度上是允許的；如產生這類情況，可進一步做確證實驗。
         3.2理化檢測法 
       理化檢測方法是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、質譜法、聯用技術等等，能進行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但有的檢測程序較復雜，有的檢測費用較高。在牛奶中抗生素殘留檢測方面，最常用的理化檢測方法是高效液相色譜和聯用技術。
         3.2.1高效液相色譜
        高效液相色譜(HPLC)是目前廣泛應用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分離速度快、效率高和操作自動化。幾乎所有的化合物包括高極性／離子型待測物和大分子物質，均可用HPLC進行測定。HPLC的分離機制與常規柱色譜相同，但填料更加精細(ф 5～10μm)，需高壓泵推動，柱效高(105塔板／m)，速度快，靈敏度與GC相近。與GC相比，HPLC流動相參與分離機制，其組成、比例和pH值等可靈活調節，如離子對色譜、膠束色譜、手性分離色譜等，使許多極難分離的待測物得以分析。反相HPLC發展最快，目前已成為大多數抗生素殘留的常規分析方法。主要原因是：(1)化學鍵合固定相(C18或C8)性質穩定，不淋失；(2)使用水、甲醇或乙腈等水溶性有機溶劑作流動相，不干擾紫外檢測，成本低；(3)樣品中極性雜質先流出，只需待測物出峰后即可重復進樣，分析速度快。

        最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。紫外檢測器(UVD)最普及，其次是熒光檢測器和電化學檢測器(EChD)。由于奶樣中藥物殘留量少，背景干擾往往很嚴重，因此一般都通過柱前衍生反應來提高紫外檢測器檢測殘留的靈敏度。彭莉等報道了用高效液相色譜法（HPLC）檢測牛奶中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯霉素，用紫外檢測器在278nm檢測樣品。平均加收率94.8％，變異系數< 12.0％。此方法樣品前處理簡單、回收率高、實用性強、檢驗靈敏度高、重現性好、檢測數據準確可靠，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的確證方法。由于大部分抗生素在高于230nm的光譜區無吸收，而在低于230nm的紫外區許多樣本基質和流動相產生干擾，需衍生化后測定，限制了紫外檢測器的應用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光檢測器有很大發展潛力。旋光檢測有以下特點：(1)選擇性高，樣本僅需簡單提取即可；(2)靈敏度高，利用He－He激光作光源，靈敏度可達5～10uα水平；(3)可同時得到流出組分的比旋度[α]，用以定性。目前，該方法已用于紅霉素、慶大霉素、羧芐青霉素和吩羧青霉素殘留的測定。
         此外，光二極管陣列檢測器(DAD)是近10年來HPLC最重要的突破。DAD可同時接收整個光譜區的信息，在色譜峰流出同時能進行每個瞬間的動態光譜掃描并快速采集信號，經計算機處理后得到色譜—光譜的三維圖譜，信息量大大增加。一次進樣可得到每個組分峰的定量、定性和純度信息，靈敏度亦明顯提高。
         3.2.2聯用技術
       各種分析技術聯用是現代獸藥殘留分析乃至整個分析化學方法上的發展特點。計算機的應用加速了這一趨勢。聯用技術可揚長避短，一般集分離、定量和定性(分子結構信息)于一體，因而特別適用于確證性分析。常見的聯用技術，有TLC－MS、GC－MS、LC－MS、CZE－MS、LC－NMR、SFC－MS等。TLC－MS是最簡單的離線聯用技術。GC－MS已相當成熟，應用相對較多。但這些聯用儀價格昂貴，遠不如HPLC或GC那樣普及。

       MS無疑可作為HPLC的通用型檢測器。使用微型柱(15×0.3cm id)和適宜的接口技術，如熱噴霧(TSP)、微粒束(PB)等解決了LC與MS的連接問題；使用軟電離技術，如快原子轟擊(FAB)、場解吸(FD)等解決了難氣化物質的離子化問題。LC－MS現在已進入實用階段，其靈敏度較熒光檢測器高1個數量級，能方便地對ng級的獸藥殘留組分進行檢測與結構確證。LC－NMR還可提供待測物立體化學方面的信息。
        LC/MS是除GC/MS之外的一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的系統。LC/MS對高沸點、不揮發和熱不穩定的化合物分離和鑒定具有獨特的優勢。色/質聯用法由于實現了高效層析分離和檢測聯機，可用微電腦控制層析條件、程序和數據處理，其特異性、靈敏度和重復性均好，并可一次同時完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測。其分析方式有直接探頭分析法、直接液體導入法、GC/MS、LC/MS聯用法等。使用電子轟擊離子化、化學電離、快速原子轟擊、熱噴霧電離、等離子體噴霧、粒子束電離、大氣壓化學電離（APCI）和電噴霧電離（ESI）技術對不同MS離子源條件下青霉素類藥物分子碎片類型的特征已經作了大量的工作。另外離子阱質譜技術（MS/MS）也已用于鑒別青霉素類藥物。如Straub等使用LC/ES/MS測定了牛奶中的幾種青霉素殘留。青霉素，鄰氯青霉素與芐青霉素的最低測定限為3～5μg/kg。Kihak  等以NCI方式的LC/PB/MS技術成功地對牛奶中OTC、TC與CTC殘留進行確證，方法檢測限為0.02～0.05μg/mL。
          3.2.3其它理化檢測方法
         牛奶中抗生素殘留檢測方法還有氣相色譜法（GC）、高效薄層色譜（HPTLC）、超臨界流體色譜(SFC)和毛細管區域電泳法(CZE)等。這些方法盡管在殘留檢測中不常用，但因其各自特有的性能，能彌補常用方法中不足之處。如GC有許多高靈敏、通用性或專一性強的檢測器供選用，如氫焰離子化檢測器(FID)、氯磷檢測器(NPD)等，檢測限可達μg/kg級；HPTLC的斑點原位掃描定量、定性和高效分離材料(Φ3～10μm)改變了常規TLC在靈敏度和重現性方面的不足，但保持了TLC的簡便、快速和樣品容量大的優點，可使用正相或反相板，分辨率幾乎與HPLC相當，在抗生素殘留的快速篩選性檢測方面應用廣泛；SFC可彌補GC和HPLC的不足，方便地連接各種靈敏的檢測器(MS，ECD等)；CZE是90年代以來研究最活躍的分析技術之一，兼有高壓電泳的高速、高分辨和HPLC靈活、高效的優點，柱效高達105塔板／m。 
         Nishi等(1989，1990)使用CZE和MEKC成功地分離了十幾個β－內酰胺類抗生素。CZE將在簡化樣本前處理、多殘留分析和分析自動化方面發揮重要作用。目前CZE的主要問題是樣品量太小，限制了檢測的靈敏度。CZE－MS可能是最好的解決辦法。
         此外，隨著接口技術的顯著改進，質譜作為一種質量流速型檢測器，正廣泛應用于殘留分析的檢測中。電化學檢測器也已用于檢測鄰氯青霉素、頭孢菌素和青霉素。
         3.3免疫法
         目前藥物殘留免疫分析技術主要分為兩大類：一為相對獨立的分析方法，即免疫測定法(immunoassays，IAs)，如RIA、ELISA、固相免疫傳感器(soindphase  immunosensor  )等；二是將免疫分析技術與常規理化分析技術聯用，如利用免疫分析的高選擇性作為理化測定技術中的凈化手段，典型的方式為免疫親合色譜(immunoaffinity chromatogrphy,IAC)。與常規的理化分析技術相比，免疫分析技術最突出的優點是操作簡單，速度快、分析成本低。以使用微量滴板的ELISA為例，免疫測定法取樣量小，前處理簡單、容量大，儀器化程度低，檢測奶與GC/MS或GC/ECD相似，可方便地達到ng/g～pg/g級，分析效率則為HPLC或GC的幾十倍以上。目前大部分抗生素已經建立了免疫測定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、鏈霉素、四環素、莫能菌素等。
        免疫分析能與其他技術聯用。在聯用方法中，免疫分析技術既可作為HPLC或GC等測定技術的樣品凈化或分離手段，如IAC/HPLIAC/GC、HOIAC/HPLC；也可作為其離線或在線檢測方法，如HPLC/IA、TLC/IA、CZE/IA、SFC/IA、FIA/IA等，這些方法結合了免疫分析的選擇性、靈敏度與HPLC、GC等技術的高速、高效分離和準確檢測能力，使分析過程簡化、分析成本下降，拓展了待測物范圍。在HPLC/IA等分析中，IA一般作為離線檢測方法。又稱免疫圖譜法（immunograms），適用于液相檢測器無響應或分離困難的殘留組分的檢測。FIA/IA可以實現IA的動態、實時和自動檢測，分析速度快，已發展為一種專門的免疫測定技術－FIIA。
         ELISA試劑盒是目前奶牛場和牛奶公司使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法。各類抗生素試劑盒為國外生產，這使得國內的奶及奶制品公司花費較大。如德國拜發公司生產的抗生素檢測試劑盒，一個96次檢測試劑盒要花3800元，每個樣品的檢測要花30～50元。對一家中小型奶制品企業而言，每年在抗生素等藥物的檢測上要花費20多萬元以上。因此很有必要研制和開發出國產的試劑盒，以降紙成本，提高經濟效益。
            　　
         4.結束語
         綜上所述，鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題，應重視和加強檢測工作，并努力研究發展一些簡單、快速和便攜化的篩選多殘留分析技術；發展高效、高靈敏的聯用技術和多殘留組分確證技術，如LC—MS、CZE—MS；實現分析過程自動化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保證消費者的健康。