在食品、醫(yī)藥、生物學(xué)、生物化學(xué)中常用到蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，隨著分析手段的不斷進(jìn)步，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法也正在向準(zhǔn)確、快速的方向發(fā)展。根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，測(cè)定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，如含氮量、肽鍵和折射率等測(cè)定蛋白質(zhì)含量，通常采用經(jīng)典的凱氏定氮法[1，2]，目前已有采用紅外連續(xù)消化、自動(dòng)蒸餾和自動(dòng)滴定裝置的自動(dòng)凱氏定氮儀；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸性基團(tuán)、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，有水楊酸比色法[3]、雙縮脲法[4]、皮尼克法、Bradford 檢測(cè)法（考馬斯亮藍(lán)染色法）[5]、Lowry 檢測(cè)法（FoLin－酚試劑法）、二喹啉甲酸（BCA）檢測(cè)法[6]、紫外吸收法、熒光探針法[7]、近紅外透射光譜法[8，9]、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳分析法。此外，還有更為先進(jìn)的羅丹明 6G 生物探針[10]、高光譜遙感技術(shù)[11]等測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法。基于凱氏定氮法的準(zhǔn)確度和普遍性，本實(shí)驗(yàn)采用凱氏定氮法，并對(duì)蒸餾后產(chǎn)物的處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，將蒸出液用納氏試劑進(jìn)行比色（以下稱該法為凱氏比色法），快速確定氮含量，提高了定氮實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可操作性，避免了凱氏定氮法中鹽酸標(biāo)準(zhǔn)試劑濃度確定的麻煩操作、滴定過程終點(diǎn)不好控制等問題，大大減輕勞動(dòng)強(qiáng)度與勞動(dòng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中利用NH4Cl作基準(zhǔn)物，將改進(jìn)法測(cè)定結(jié)果與實(shí)際氨氮加入量進(jìn)行比較，結(jié)果表明改進(jìn)法對(duì)測(cè)定蛋白質(zhì)含量是可行的。

　　1 實(shí)驗(yàn)部分
　　
　　1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品
　　凱氏定氮裝置、101-1A 型數(shù)顯式恒溫干燥箱（上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、液晶顯示分析天平（上海天平儀器廠）、722分光光度計(jì)（上海天平儀器廠）；干酪素（光譜純）、納氏試劑。
　　1.2 實(shí)驗(yàn)步驟
　　1.2.1 納氏試劑比色法工作曲線確定
　　稱取3.819g在100℃條件下干燥過的無水NH4Cl，用去離子水定容至1 000ml，氨氮濃度為1.0mg/ml。取出10.00ml該溶液轉(zhuǎn)入1 000ml容量瓶中定容，則此時(shí)氨氮濃度為0.01mg/ml，分別取此溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、7.00、10.00ml于50ml 比色管中，加無氨水至標(biāo)線，先加入1.00ml酒石酸鉀鈉溶液充分搖勻，再加入1.5ml 納氏試劑搖勻，10min后，以空白試劑為參比，用1cm比色皿在420nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　1.2.2 凱氏滴定法實(shí)驗(yàn)步驟
　　1.2.2.1 消化
　　準(zhǔn)確稱取2.000g干酪素，放入250ml凱氏燒瓶中，加入混合消化液（硫酸：雙氧水：水＝2：3：1）20ml，催化劑為1：1的硫酸鈉和硫酸銅2g。將燒瓶置于電熱套中加熱消化，先低溫加熱，10min 后升溫，使瓶?jī)?nèi)液體微沸至呈藍(lán)綠色透明，繼續(xù)保持微沸，待消化徹底，轉(zhuǎn)移到容量瓶定容500ml，待用。以后每次取2ml液體測(cè)定。
　　1.2.2.2 蒸餾
　　將凱氏燒瓶按蒸餾裝置連好，以5.0ml硼酸為吸收液，于其中加入3 滴甲基紅-溴甲酚綠指示劑，從漏斗中加入40％的NaOH溶液2ml，邊加邊搖動(dòng)凱氏瓶，直至瓶?jī)?nèi)液體變?yōu)樯钏{(lán)色，再加熱蒸餾至氨全部蒸出。
　　1.2.2.3 滴定
　　將上述餾出液用0.119 1mol/l鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（無水碳酸鈉滴定）滴定硼酸吸收液，至藍(lán)色變?yōu)槲⒓t色即為終點(diǎn)。記錄鹽酸溶液的用量，同時(shí)做一空白對(duì)照組。
　　1.2.3 結(jié)果計(jì)算
　　凱氏滴定法滴定值計(jì)算公式：

　　式中：C——標(biāo)準(zhǔn)鹽酸濃度0.119 1mol/l；
　　V1——滴定試樣用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積（ml）；
　　V0——滴定空白樣用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積（ml）。
　　比色法吸光度值確定蛋白質(zhì)含量公式：
　　N%=(Y-K)X250/(bX樣品重)X100%
　　式中：Y——吸光度A420；
　　K——工作曲線截距；
　　b——工作曲線斜率。

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 納氏試劑比色法吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線
　　y= 0.094 86+0.216 29x，R=0.999 35
　　2.2 樣品測(cè)定結(jié)果
　　用凱氏滴定法和凱氏比色法分別測(cè)定5組干酪素樣品，結(jié)果如表1。

　　由表1中數(shù)據(jù)可知，5組測(cè)定結(jié)果的平均值相對(duì)偏差為1.395%，說明兩種方法的測(cè)定結(jié)果的偏差較小，有很好的一致性。

　2.3 凱氏比色法準(zhǔn)確性驗(yàn)證
　　2.3.1 NH4Cl溶液氨氮含量測(cè)定
　　將分析純NH4Cl配成0.910 0g/l溶液，則溶液氮含量實(shí)際值為0.053 5g/l，用凱氏比色法測(cè)定該溶液的氮含量，從而考察凱氏比色法的準(zhǔn)確性（見表2）。
　　由2表中數(shù)據(jù)可知：凱氏比色法測(cè)定值的最大正偏差為0.000 88，最大負(fù)偏差為-0.000 48，方差為0.000 48，說明凱氏比色法測(cè)定數(shù)據(jù)的精密度比較好。同時(shí)，可以看出，凱氏比色法的測(cè)定值與NH4Cl溶液的實(shí)際氮含量偏差為+0.001 59，計(jì)算相對(duì)偏差為+2.971%，在可接受范圍內(nèi)，說明凱氏比色法的測(cè)定結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

　　2.3.2 秸稈中粗蛋白含量測(cè)定
　　玉米秸稈樣品處理：準(zhǔn)確稱取粉碎秸稈樣品，采用5種不同預(yù)處理方式（見表3），用凱氏比色法和凱氏滴定法比較測(cè)定結(jié)果（見表4），每組樣品平行測(cè)定3次。

　　由測(cè)定結(jié)果可以看出，凱氏比色法與凱氏滴定法測(cè)定秸稈中蛋白質(zhì)含量的最大相對(duì)偏差為2.94％。

　　3 結(jié)論
　　凱氏滴定法操作過程中，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸吸收液，而鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的確定以及吸收液滴定終點(diǎn)的確定對(duì)操作的要求都很高。實(shí)驗(yàn)中將硼酸吸收液用納氏試劑比色原理進(jìn)行納氏試劑比色，大大減輕了工作難度，在對(duì)干酪素的測(cè)定過程中，凱氏滴定法與凱氏比色法的測(cè)定結(jié)果平均值相對(duì)偏差僅為1.38%。在凱氏比色法的準(zhǔn)確性測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，利用已知氮含量為0.0535g/l的NH4Cl溶液進(jìn)行檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得值與實(shí)際值的相對(duì)偏差為+2.97%，在可接受范圍內(nèi)。另外，在玉米秸稈粗蛋白含量測(cè)定試驗(yàn)中，測(cè)定結(jié)果的最大相對(duì)偏差為2.94％。因此，凱氏比色法可以用于蛋白質(zhì)含量的定量分析研究。

　　參考文獻(xiàn)（略）