牛海綿狀腦病（BSE，又稱瘋牛病）是牛的一種致死性神經系統疾病，即眾所周知的傳染性海綿狀腦病（TSE），最近科學家推測進食含BSE的牛肉與人群發生變異型克雅氏病（vCJD）有關［1～2］。這些疾病的特征是潛伏期長，可從數月至數年，潛伏期內無可見癥狀，牛BSE平均潛伏期為4～6年，在人是至少9年[2]，患者出現短暫神經癥狀后死亡，目前尚無有效治療方法。目前在英、法、德、瑞士、丹麥、阿曼、葡萄牙、愛爾蘭、比利時、盧森堡、西班牙、意大利等國均有報道。至2000年1 月份，英國共有384萬多頭牛被銷毀。自從英國于1996年發生第1例vCJD病以來，到2000年1月，單英國就有52人患此病死亡。因此BSE對人畜健康和食品安全衛生的影響后果非常巨大，引起世人廣泛關注。對于該病病原，普遍認為是由一種蛋白質性的感染顆粒也稱為朊蛋白引起的，是一種病理細胞朊蛋白（PrPSc），由正常細胞朊蛋白（PrPc，約250個氨基酸的蛋白質）轉變而來，不含DNA或RNA。病原對外界理化因素抵抗力極強，高壓蒸汽滅菌134～138℃ 18 min不能使病牛腦組織完全滅活，對次氯酸鈉溶液，NaOH溶液有很強抵抗力，常規組織固定方法不能滅活。BSE流行病學和傳播途徑研究表明，BSE的發生可追溯到被TSE如癢病病原污染的加工飼料成分、白粉及肉骨粉（MBM）等[1～2]， MBM是哺乳動物組織加工產品，是最普遍應用的動物飼料的蛋白質來源，MBM被認為是主要的傳播途徑，而今MBM在許多國家被禁用于反芻動物飼料，對動物飼料的控制、禁止使用反芻動物蛋白甚至所有哺乳動物組織成分詞喂反芻動物，禁止牛源性風險成分進入動物及人食物鏈是防止BSE侵入和傳播，保證人身安全免受VCJD侵害的關鍵措施。中國、歐盟各國、美國、日本等國都頒布了有關公告和禁令。能否很好地執行這些規定在很大程度上取決于檢測食品及反芻動物飼料中的禁止成分。食品和飼料中動物性成分及種類鑒別分析方法主要取決于對DNA、蛋白及骨片段的分析。但是食品和飼料制備過程中的熱處理可破壞及降解DNA及蛋白質，因此對這些分析方法有一定影響。
1 DNA分析方法
DNA分析方法是分離鑒定生物性材料的一種常用方法，DNA存在于細胞核中（基因組DNA）、線粒體（線粒體DNA）以及植物細胞葉綠體等細胞器中。熱處理對DNA的結構有兩種影響，其一是使DNA變性，雙股DNA分子變成單股，某一DNA分子變性的溫度各不相同，取決于GC含量、鹽分、長度及 DNA拓樸結構等。線性DNA通常在60～100℃變性；其二是改變DNA的初級結構，高溫高壓下DNA分子變成短片段。DNA分析方法的目標序列通常是種間高度保守的序列，核糖體DNA是常用的種類鑒別序列，衛星DNA及隨機重復序列也被應用到，其他數種染色體及線粒體DNA也被用于肉類鑒別，DNA分析方法常選用雜交及選擇性擴增方法。
1．1 DNA雜交DNA雜交方法分指紋技術及完整DNA方法。前一種常用Southern印跡，在雜交前DNA被酶切成小片段，并按大小分開；另一種方法，如斑點雜交方法適用完整DNA分子。DNA指紋技術不適用于化制產品，因為DNA降解過程會產生不同大小的DNA片段，將會影響結果判定。斑點雜交技術適用于熱處理產品，該方法被應用于80℃、100℃及120℃加熱處理的雞、豬、山羊、綿羊及牛肉的DNA分析，探針是使用每種動物的基因組 DNA。該方法檢測限可達0．l mg。但是山羊、綿羊與牛存在很大交叉反應，因為他們的基因組很相似。交叉反應可用未標記的綿羊DNA進行阻斷。為了鑒別熱處理肉類，以衛星DNA為靶序列設計的22個堿基的探針用于鑒別牛、山羊、綿羊、馬、鹿、豬、雞和火雞肉，經過120℃ 90 min高壓處理，雖然強度減弱但雜交信號仍很清晰，檢測限可達l％～5％，另外用PCR產生的可與種類特異性衛星DNA結合的探針雜交技術更耐用，可檢測鮮肉0．l％～0.5％，高壓處理肉樣品0. 5 ％～5 ％ [2]。
1．2 PCR擴增 PCR技術是應用耐熱DNA聚合酶特異性地擴增目的DNA片段，擴增的片段可以用以下方法進行分析和鑒別：凝膠電泳、DNA測序、單鏈同一性分析（SSCA）、質譜分析等。PCR方法使用幾種不同的目的序列，線粒體DNA是一種很好的序列，因為每個細胞中含有大量線粒體基因組（約2 300個拷貝），方法的靈敏度大大提高，Tartaglia等［3～4]介紹一種檢測反芻動物飼料中牛線粒體的PCR方案，該方法以牛線粒體DNA的 tRNA的3´端、ATPase 8和ATPase 6的氨基端為目的片段，此片段在植物中未發現，并且在脊椎動物中表現為高度變異性。該方法可以檢測牛源性MBM 0．125％樣品中的牛線粒體DNA，該方法經FDA多方評估，但沒有確定靈敏度，也非定量。而且該方法是牛特異性的，不能檢測其他反芻動物成分。另一種方法應用于鹽腌、加熱或發酵肉品的種類鑒別[5～6]，所用引物是脊椎動物線粒體Cytb基因的保守區互補系列。對目的DNA片段的限制性內切酶分析可檢出多種野生動物及豬、牛、山羊、馬、雞、火雞的限制性片段多態性，PCR－RFLP分析方法從含牛肉的熱處理肉類混合物中檢出低于l％的牛肉。22種未知 cytb基因序列的動物包括偶蹄動物和禽類的種內和種間差異可用20種不同限制性內切酶進行分析。有人研究了熱處理肉中豬肉的PCR檢測方法［7～8]，該方法擴增18S核糖體及線粒體基因高度保守區序列，可從鮮肉及熱處理牛肉和豬肉混合物中檢出低于2％的豬肉。
哺乳動物廣譜性的間斷性重復序列用于包括牛以及鴕鳥近30種動物DNA的指紋分析，該方法可產生20～60條帶，比等電聚焦電泳分析（IEF）信息更豐富。經 120℃ 20 min處理的肉類及這些動物的DNA均用該序列的引物擴增，經DNA測序分析，雖然熱處理引起DNA降解（至300 bp大小），但與同種動物的完整DNA鑒定結果是一致的。
2 蛋白質分析方法
熱處理對蛋白結構的影響有4種情況：第一，使蛋白變性，改變蛋白二、三級結構，打開氫鍵及破壞其他較弱的二三級聯系；第二，改變蛋白質的初級結構，在較高溫度及壓力下，氨基酸間共價鍵斷裂，蛋白質降解至多肽；第三，氧化－SH鍵成S－S鍵；第四，蛋白質與碳水化合物反應形成復合體。任何一種旨在分析熱處理蛋白的方法必須將這些因素考慮在內，這些方法主要是免疫學和電泳方法。
2．1 免疫學方法 很多免疫學方法用來鑒別粗加工肉類的動物種類，但是不能用于熱處理肉品，常用的免疫學方法是ELISA及Western印跡及生物傳感器技術。
2．1．1 肉類分析的ELISA方法 ELISA是一種基于可溶性抗原與抗體反應的簡便方法，該方法不能檢測變性凝聚的熱處理蛋白。另外，還有一些成分如明膠可能與抗體交叉反應給出假陽性結果。英國及愛爾蘭檢測飼料中牛源蛋白的官定方法是應用硫酸銨沉淀可溶性蛋白除去明膠，濃縮蛋白，然后應用熱穩定性多克隆抗體雙夾心 ELISA方法。這種樣品純化／ELISA方法可以檢測加熱140℃1.5 h的動物飼料中的牛羊熱穩定蛋白。但是硫酸銨沉淀使該方法相當繁瑣，對方法的重復性沒有進行研究，另外這種方法可以檢測大多數牛蛋白，不能區分禁止與允許蛋白[9]。
其他還有一些檢測蒸煮肉類蛋白ELISA方法，例如 Cortecs診斷公司 ELISA試劑盒鑒定經 133℃20 min熱處理的豬、牛、禽肉中的羊肉。 138℃ 20min高溫則無效，另外還有應用熱穩定性抗原的特異性多克隆抗體檢測煮肉、罐頭肉中的禽肉。當樣品處理120℃15min其檢測限分別是：雞和火雞 126mg／kg，豬肉250mg／kg［10］。有些學者應用單克隆抗體檢測煮禽肉中的任何哺乳動物肉類，一種單克隆抗體與經 100℃15 min加熱的五種哺乳動物（肉牛、豬、綿羊、馬、鹿）有強烈反應。但不與雞、火雞和鴨或0．5％的鮮肉反應［11］
2．1．2 生物傳感器生物傳感器依靠某些物質與表面固化的受體分子如抗體的反應來選擇性檢測溶液中的目標成分如毒素、某種特定蛋白等。生物傳感器在食品中有所應用，還未適用于飼料。
2．2 電泳方法 廣泛應用的是SDS－PAGE、毛細管電泳（CE）和等電聚焦（IEF）次之。
2．2.1 肉品的SDS－PAGE分析 應用SDS去污劑將蛋白變性及固定，帶負電荷的SDS與肉品蛋白結合，蛋白所帶凈電荷與蛋白分子量大小成比例（蛋白自身所帶電荷忽略不計），帶負電荷蛋白被PAGE按大小分開，通過染色觀察，每塊膠可分析10～20個樣品。經100℃ 20 min加熱的豬肉可以經 SDS－PAGE分析，溫度稍高（135℃ 20 min）蛋白變性，蛋白帶強度減弱，低分子量蛋白背景加深，被降解程度取決于完整蛋白的分子量，一般而言，高分子量蛋白比低分子量蛋白降解程度大，肌球蛋白曾用于鑒別不同動物種類）[2]， SDS－PAGE曾用于求加工及加工樣品的魚種類鑒別，尿素及SDS用作提取，SDS比尿素提取法受樣品狀態（粗制品、60℃、85℃）的影響小。
Western免疫印跡是另一種免疫學方法，抗原成分先用SDS－PAGE分開，轉移到膜上，然后與抗體反應，該方法曾用于罐頭食品中細菌毒素分析，組織中是否存在牛源性CNS成分[12]及 PrPSc鑒定［13］。該方法與ELISA相比有幾個優勢，第一是蛋白經SDS－PAGE彼此分開并且與其他成分分開，所以不需硫酸按沉淀，可用于經 SDS固化的熱處理蛋白的分析，另外易于干擾抗體結合的明膠也與其他蛋白分開，本方法檢測限可達l ng／ml，免疫印跡法是一種重要的免疫學方法，可鑒定特異蛋白種類，使用特異性抗體可鑒別哺乳動物蛋白，并將禁止蛋白與允許蛋白分開。
2．2．2 毛細管電泳（CE）是在毛細管中以很高電壓進行電泳，這樣可以快速分離，提高清晰度及自動化程度。SDS聚合物充填的毛細管凝膠電泳（CE－SDS）用于鑒別肉蛋白的動物種類，肌質蛋白的CE－SDS圖譜可用于動物種類的定量及定性特異性分析[2]，但尚未用于加熱肉類的分析。
2．2．3 IEF IEF是另一種蛋白電泳方法，廣泛用于魚種鑒別，尿素等電聚焦電泳（UREA－IEF）用于鑒別粗加工及熱處理的魚類，受熱處理影響很小，牛肌球蛋白的熱穩定性曾用IEF進行分析［2]，可檢測0．01mg／ml肌球蛋白，溫度升高及時間延長，肌球蛋白凝膠強度減弱。
3 組織鑒定方法
3．1 骨組織鑒別 骨組織較普遍存在于動物性粉中。不象其他組織，骨組織可耐受熱處理，是飼料分析的目標之一。飼料鏡檢廣泛應用于反芻動物飼料中哺乳動物的檢測，作為一種簡單便利的方法收入AOAC官定方法［14］，通過觀察，可以區分哺乳動物、禽類和魚類。該方法需要相當有經驗的檢驗員，骨片段的檢測限在0．1％以下，可定量，但該方法本身不能區分動物的種類。
3．2 BSE及BSE相關組織分析上述一些方法是食品中動物成分檢測分析的一般方法，除此而外，還有一些旨在檢測BSE特征性的組織成分，主要是中樞神經組織（CNS），也有一些檢測脫病毒相關蛋白PrPSc的方法。
3．2．1 牛CNS組織分析 BSE通過神經組織擴散，對食品中CNS組織存在的分析顯得特別重要。已有肉產品中CNS檢測方法的報道[12]，神經元特異性的烯酸化酶抗原對勻漿及高壓熱處理穩定。應用抗烯醇化酶抗原的單克隆及多克隆抗體的Western印跡方法，可以從香腸中檢出豬肉中含1％～4％的牛腦成分。去除樣品中脂肪組織靈敏度進一步增強，應用單克隆抗體可檢測0．25％的腦組織。更特異性的牛CNS分析方法是檢測膠質纖維酸性蛋白，作為肉牛血及肌肉組織中CNS組織的標志物，在骨骼肌、血凝塊及坐骨神經中檢出少量或不能檢出，相反在CNS各部分均能大量檢出。
3．2．2 檢測朊蛋白 BSE診斷主要依賴于組織學分析，另一種方法是應用ELISA檢測PrPSc。PrPc分子的抗蛋白酶核心位點的抗體應用于檢測正常及BSE動物的腦組織中PrPc的含量，對天然組織，兩組差異很小，但當加熱及異硫氰酸胍處理后，ELISA可將牛腦勻漿物中BSE特異性的 PrPSc與PrPc區分開來，無明顯臨床癥狀的BSE感染動物可被檢出，經對朊蛋白Western印跡法檢測牛及羊朊病毒蛋白的靈敏度、特異性及可靠性進行分析，證明該方法是有效的。
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本文介紹了當前食品和飼料中動物性成分和動物種類鑒別的3種途徑，即DNA、蛋白質和相關組織分析法，其中DNA分析方法具有明顯優勢。但到目前為止，以檢測飼料中牛源性成分的方法居多，動物種類鑒別方法以PCR－RFLP分析給出比較豐富的信息。能否設計出反芻動物特異性的PCR方法，特別是反芻動物甚至哺乳動物特征性的快速定量方法乃是今后此類研究之趨勢。
