關(guān)鍵詞：大豆粉；脲酶活性；蛋白質(zhì)溶解度；pH增值法；滴定法
眾所周知，大豆含有較豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，是飼料生產(chǎn)中主要的植物蛋白質(zhì)源之一，具有較高營養(yǎng)價(jià)值。但是，大豆中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃腸脹氣因子、抗維生素因子、抗原蛋白等，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子阻礙營養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不僅會(huì)降低飼料營養(yǎng)成分的消化率和適口性，而且也會(huì)影響動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收，對(duì)動(dòng)物生長發(fā)育也產(chǎn)生不良的影響。但是，胰蛋白酶抑制因子的測定較困難，而豆粕中脲酶活性與胰蛋白酶抑制因子活性呈正相關(guān)，所以通常通過測定脲酶活性來反映蛋白酶抑制因子的活性。
目前，脲酶活性的測定方法有滴定法（國標(biāo)法）、pH增值法等，目前，對(duì)脲酶活性不同測定方法差異性的研究較少，本文擬對(duì)兩種方法進(jìn)行研究，以比較不同方法對(duì)測定結(jié)果的影響，為實(shí)際生產(chǎn)和理論研究提供依據(jù)和參考。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
大豆粉：將生大豆粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩。在85℃和140℃下分別處理0、45、90、135和180min冷卻后裝入封口袋保存?zhèn)溆谩?BR> 1.2 化學(xué)試劑
本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純（AR），實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。
1.3 測定方法
1.3.1 pH增值法
實(shí)驗(yàn)原理：將研細(xì)的試樣與尿素緩沖液混合，尿素在尿素酶作用下水解產(chǎn)生氨，使溶液pH 值改變，改變的程度與脲酶活性大小相關(guān)，因此可以用其與空白溶液的差值表示脲酶活性高低，單位為△pH值。
（1）主要溶液配制
磷酸緩沖液：將3.403g磷酸二氫鉀加入100mL水中溶解；將4.335g磷酸氫二鉀溶于100 mL水中；將兩種溶液混合，稀釋至1 000 mL。用弱酸或弱堿調(diào)至pH=7.0。
尿素緩沖液：將15g尿素加入500mL上述磷酸緩沖液中。用弱酸或弱堿調(diào)至pH=7.0。
（2）操作方法
取0.200g試樣，裝入比色管中，加入10mL尿素緩沖液，迅速蓋上蓋子，劇烈搖動(dòng)。將比色管置于30±0.5℃的恒溫水浴鍋中，準(zhǔn)確保持30min。
另稱取等量試樣放入另一支比色管中，加入10mL磷酸緩沖液，迅速蓋上蓋子，將試樣與緩沖液混合均勻，置于水浴鍋中保持30min，作為空白試驗(yàn)。
每隔5min將水浴鍋中比色管中的試樣搖勻一次。
每個(gè)比色管保持30min后，從水浴鍋中取出，將上清液倒入小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5min時(shí)，用酸度計(jì)測出pH值。
（3）計(jì)算公式
UA= pH1－pH0
式中：UA—脲酶活性，△pH；
pH1—樣品使尿素分解后樣液的pH值；
pH0—空白樣液的pH值。
1.3.2 滴定法
原理：樣品與中性尿素緩沖液混合，在30±0.5℃下保持30min，樣品中脲酶催化尿素水解產(chǎn)生氨，用過量的鹽酸中和氨，再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液回滴到溶液pH 值為4.7。脲酶活性用每克樣品在30±0.5℃下每分鐘產(chǎn)生氨態(tài)氮的毫克數(shù)表示，單位為NH3 mg/g·min。
（1）溶液配制
尿素緩沖液：將8.95g磷酸氫二鈉和3.40g磷酸二氫鈉溶于水中，并稀釋至1 000mL，再將30g尿素溶于此磷酸緩沖液中。
0.1mol/L鹽酸溶液：8.3mL鹽酸注入1 000 mL水中。
0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉溶于水中，并稀釋至1 000mL。
（2）操作方法
①氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)定
稱取0.6g于105～110℃烘至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀（準(zhǔn)確至0.000 1g），溶于50mL水中，加2滴酚酞指示劑，用配制好的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈粉紅色。同時(shí)做空白試驗(yàn)。
②UA的測定
稱取0.200 0g試樣，轉(zhuǎn)入比色管中，加入10 mL尿素緩沖液，立即蓋好蓋子并劇烈搖動(dòng)。置于30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30min后立即加入10mL 0.1mol/L鹽酸，迅速冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2～3次，立即用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
另取比色管做空白試驗(yàn)，加入10mL尿素緩沖液，10mL 0.1mol/L鹽酸。稱取與上述試樣量相當(dāng)?shù)脑嚇樱杆偌尤氡壬苤校⒓瓷w好比色管并劇烈搖動(dòng)，在30±0.5℃恒溫水浴上準(zhǔn)確保持30 min，冷卻到20℃，將比色管內(nèi)容物全部轉(zhuǎn)入燒杯，用水沖洗比色管2～3次，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至pH＝4.7。
（3）計(jì)算公式
U=14×c（V0-V）/30×m
式中: U—每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量表示的脲酶活性；
c—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度（mol/L）；
V0—空白試驗(yàn)消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積（mL）；
V—測定試樣消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液體積（mL）；
m—試樣質(zhì)量（g）。
1.3.3 蛋白質(zhì)溶解度的測定
原理：氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度可以反映大豆粕產(chǎn)品加熱過度的情況，不同加熱程度的大豆粕，蛋白質(zhì)在氫氧化鉀溶解度不同。先測定大豆粕樣品在規(guī)定的條件下，可溶于氫氧化鉀溶液中的粗蛋白質(zhì)含量，再測定同一大豆粕樣品中總的粗蛋白質(zhì)含量，計(jì)算出氫氧化鉀蛋白質(zhì)溶解度。
（1）操作方法
稱取樣品1.5g，置于250mL燒杯中，用移液管移取75mL氫氧化鉀溶液，用磁力攪拌器攪拌20min，再將攪拌好的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以2 700r/min離心10min，用移液管移取濾液15mL，放入消化管中，用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。
另稱取0.3g樣品，按照凱氏半微量定氮法測定原料樣品中的粗蛋白質(zhì)含量。
（2）計(jì)算公式
蛋白質(zhì)溶解度＝15mL上清液中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量（g）/0.3g試樣中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量（g）
2 結(jié)果與分析
2.1 85℃下不同加工時(shí)間段下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
由表1可見，85℃加熱0～180min的條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度變化不明顯。結(jié)果表明85℃下熱處理對(duì)大豆蛋白破壞作用不明顯，該溫度大豆粉中的蛋白酶抑制劑的活性不足以被破壞。滴定法和增值法測得的脲酶活性大小，在數(shù)值上差異較小。
表1 85℃下大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
|
加熱時(shí)間min |
脲酶活性 |
蛋白質(zhì)溶解度/% | |
|
pH增值法UA（△pH） |
滴定法UA（NH3 mg/g·min） | ||
|
0 |
2.30 |
2.47 |
82.11 |
|
45 |
2.22 |
2.43 |
81.05 |
|
90 |
2.16 |
2.40 |
80.07 |
|
135 |
2.08 |
2.38 |
76.84 |
|
180 |
2.00 |
2.35 |
75.03 |
2.2 140℃下不同加工時(shí)間段下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
由表2可見，140℃加熱條件下，大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度隨加熱時(shí)間延長而降低，135min時(shí)，pH增值法測定的脲酶活性為0；蛋白質(zhì)溶解度從82.1%降至22.5%。表明140℃熱處理對(duì)大豆蛋白和脲酶活性破壞明顯，即140℃熱處理可以破壞大豆粉中蛋白酶抑制劑活性，但對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)也有不良影響。兩種方法測得的脲酶活性大小與85℃熱處理一樣，在數(shù)值上滴定法稍大，但與增值法無明顯區(qū)別。
表2 140℃下大豆粉脲酶活性及蛋白質(zhì)溶解度
|
加熱時(shí)間min |
脲酶活性 |
蛋白質(zhì)溶解度/% | |
|
pH增值法UA（△pH） |
滴定法UA（NH3 mg/g·min） | ||
|
0 |
2.30 |
2.47 |
82.1 |
|
45 |
0.15 |
0.20 |
72.5 |
|
90 |
0.04 |
0.05 |
53.8 |
|
135 |
0.00 |
0.02 |
33.7 |
|
180 |
0.00 |
0.00 |
24.3 |
3 討論
3.1 兩種方法對(duì)脲酶活性測定結(jié)果的比較
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雖然不同方法測定同一樣品的結(jié)果在數(shù)值上不完全相等，但兩種方法所測得脲酶活性的強(qiáng)弱趨勢(shì)相一致。國家在制定大豆餅粕脲酶活性的測定方法（滴定法）時(shí)，規(guī)定了用此方法所測數(shù)值不應(yīng)大于0.4NH3mg/g·min。從表1和表2結(jié)果可見，在85℃條件下，作用0～180 min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性均未能達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，表明在該條件下產(chǎn)品所含胰蛋白酶抑制因子的被破壞程度較低，對(duì)大豆粉蛋白的質(zhì)量影響不大。相對(duì)而言，在140℃下，作用0～180min內(nèi)，大豆粉的脲酶活性已大大降低，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，尤其是當(dāng)作用時(shí)間超過135 min后，兩種方法測定的結(jié)果顯示被測樣品中脲酶活性為0。
3.2 脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度的關(guān)系
除了脲酶活性外，近的來蛋白質(zhì)溶解度也成為判定大豆制品質(zhì)量的常用指標(biāo)。由于脲酶活性高低反映大豆餅粕受熱程度，可間接反映蛋白酶抑制因子活性高低，但當(dāng)脲酶活性為0后，進(jìn)一步加熱，脲酶活性仍為0，即此時(shí)脲酶活性不再反映大豆餅粕的受熱程度，而蛋白質(zhì)溶解度仍可隨受熱程度的增加進(jìn)一步降低，因此，脲酶活性主要用于評(píng)價(jià)大豆制品是否過生，在反映大豆及其制品的加工是否受熱過度方面，用蛋白質(zhì)溶解度來評(píng)判更為適宜。
Araba和Dale研究結(jié)果表明，當(dāng)大豆粕的蛋白質(zhì)溶解度低于70%時(shí)，很可能影響其營養(yǎng)價(jià)值，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解度低于65%時(shí)，則大豆粕肯定已加熱過度。近年來，隨著加工技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，完全可以生產(chǎn)出蛋白質(zhì)溶解度超過85%甚至達(dá)到90%，而脲酶活性接近于0的優(yōu)質(zhì)大豆產(chǎn)品。
表1和表2結(jié)果顯示，大豆粉的蛋白質(zhì)溶解度隨著加工溫度的提高和作用時(shí)間的延長而下降。在140℃下，隨著時(shí)間延長，大豆粉蛋白質(zhì)溶解度降低更加顯著。同時(shí)，兩種方法的測定結(jié)果在數(shù)值上不能相互替代，由此可見，在對(duì)大豆餅粕脲酶活性進(jìn)行表述或提出具體限量要求時(shí)，應(yīng)明確測定方法，避免引起不必要的糾紛。在鑒定豆粕質(zhì)量時(shí)，脲酶活性只能判定非營養(yǎng)成分的鈍化程度，而對(duì)過度加熱的豆粕蛋白變性程度卻無法測定，故建議用脲酶活性與蛋白質(zhì)溶解度相結(jié)合的檢測手段進(jìn)行評(píng)價(jià)。
（參考文獻(xiàn)略）
