摘 要：本文采用過甲酸氧化水解法處理飼料及飼料原料樣品、通過日立L-8900氨基酸自動分析儀檢測樣品中的含硫氨基酸含量，結果顯示：每份試樣平行測試結果相對偏差小于4％，蛋氨酸和胱氨酸峰面積回收率在93.02％～102.06％，該方法測定含硫氨基酸的重復性和準確性良好，氧化水解法比常規鹽酸水解法處理樣品檢測含硫氨基酸，檢測結果更為準確。
    關鍵詞：氧化水解；含硫氨基酸；飼料；飼料原料；氨基酸分析儀

    1 引言
    用于全氨基酸測定的樣品，凡是以蛋白質形式存在的都要進行水解處理，水解方法有3種：
    一是酸水解法（6mol/L鹽酸溶液、110℃真空水解24h）。即標準水解法，是普遍采用的水解方法，此方法的特點是水解徹底，但色氨酸遭破壞，不能測量；含硫氨基酸部分氧化，不能測準。
    二是堿水解法。用NaOH（LiOH、Ba（OH）2）作為水解劑，色氨酸不被破壞，主要用于HPLC法測色氨酸。
    三是氧化水解法。將含硫氨基酸（如：胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）用過甲酸氧化變成穩定物質，然后再進行酸水解。
    飼料及原料中的含硫氨基酸（蛋氨酸和胱氨酸）是畜禽生長的必需氨基酸，為能充分利用飼料原料中的蛋氨酸和胱氨酸，必須準確測定二者的含量，以便合理地配制畜禽日糧。蛋氨酸和胱氨酸的檢測，必須采用過甲酸氧化，使之轉變為其氧化物蛋氨酸砜和磺基丙氨酸，所生成的這些對酸穩定的氧化物，再通過鹽酸水解法從蛋白質中釋放出來，用離子交換色譜法（氨基酸分析儀）分離測定。

    2 試驗部分
    2.1 儀器與設備
    L-8900氨基酸分析儀，電子分析天平，實驗室超純水機，電熱鼓風干燥箱，真空干燥箱。
    2.2 藥品與試劑
    檸檬酸鈉（AR），氯化鈉（AR），氫氧化鈉（AR），鹽酸（GR），冰乙酸（GR），蛋氨酸砜標準品（Sigma），磺基丙氨酸標準品（Sigma）。
    過甲酸溶液：將30％過氧化氫與88％甲酸按1:9（V/V）混合，室溫放置1h，置冰水浴中冷卻30min，臨用前配制。
    氧化終止劑：48％氫溴酸。
    酸解劑：7.2mol/L鹽酸溶液（將3體積優級純鹽酸與2體積超純水混合）。
    磺基丙氨酸－蛋氨酸砜標準貯備液：準確稱取磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸砜113.3mg，加水溶解并定容至250mL，各組分濃度分別為2.5umol/mL。
    氨基酸混合標準貯備液：含有L-天門冬氨酸等17種常規蛋白質水解分析用氨基酸，各組分濃度為2.5umol/mL。
    2.3 試驗樣品
    取具代表性的飼料及原料樣品（來自廣東海大集團股份有限公司），用四分法縮減、粉碎并過40目篩，充分混勻，備用。
    2.4 試驗步驟
    2.4.1 樣品前處理
    準確稱取50～70mg試樣雙份于25mL水解管中，在冰水浴中冷卻30min后，加入已冷卻的過甲酸溶液2mL，待樣品全部潤濕（不能搖動），蓋好試管塞，連同冰浴一起置于0℃冰箱中，反應18h。
    于各管中加入氫溴酸0.3mL，振搖，放回冰浴靜置30min，取出，放至室溫后，加入10mL鹽酸酸解劑，真空泵抽真空約1min，沖入普通氮氣約1min，蓋緊試管蓋，置于110℃恒溫鼓風干燥箱中，水解24h。
    取出水解管，冷卻，用水定容至100mL。充分混勻，濾紙過濾，準確吸取1mL于10mL燒杯中，并于真空干燥箱，蒸發至干。加入2mL 0.02mol/L鹽酸溶液，充分溶解，0.2um濾膜過濾，上機。
    2.4.2 色譜條件
    按日立公司的操作手冊要求配制標準分析用pH1#、2#、3#、4#、5#洗脫溶液和茚三酮試劑R1、茚三酮緩沖溶液R2。泵1（洗脫溶液）流速：0.40mL/min（壓力2.0～14.7MPa）；泵2（茚三酮溶液）流速：0.35mL/min（壓力0.2～2.0MPa）；分析柱溫度：57℃；反應器溫度：135℃；進樣體積：20μL。檢測波長為570nm，其中脯氨酸檢測波長為440nm。
    2.4.3 樣品中含硫氨基酸的測定
    按外標法，將各樣品經氨基酸自動分析儀檢測所得的蛋氨酸和胱氨酸色譜峰面積代入其相應的標準曲線方程，求得不同組分樣品中蛋氨酸和胱氨酸的含量。

    3 結果與討論
    3.1 氨基酸分析儀分析條件的選擇 
    日立L-8900氨基酸分析儀包括6部分：輸液單元（泵與管路）——輸送緩沖液、反應液在流路系統中流動；進樣單元（自動進樣器）——將樣品在流動相的帶動下送入儀器體系中；分離單元（離子交換柱、柱溫箱）——主要是樣品的分離、將混合的樣品分離成單一組分；反應單元（反應柱、反應溫度加熱設備）——被分離的單一組分物質與反應液在反應單元反應，生成可檢測物質；檢測單元（分光光度計）——準確檢測單一組分物質的電能信號（mv）；程序控制、數據處理（工作站）——儀器的運行程序控制、檢測結果的處理。其中心部件是填料為3μm磺酸型陽離子樹脂分離柱，帶有大量負電荷。所有的氨基酸在低pH值的條件下都帶有正電荷，在陽離子交換樹脂上均被吸附，但吸附的程度不同，堿性氨基酸結合力最強，其次為芳香族氨基酸，中性氨基酸、酸性氨基酸結合力最弱。
    L－8900氨基酸分析儀采用梯度洗脫，梯度洗脫液有6種： B1～B4為檸檬酸鹽緩沖液，pH值分別為3.3、3.2、4.0和4.9，B5是超純水，B6是再生液（0.8％氫氧化鈉溶液）。每種氨基酸分辨率在1.2以上，真正完全分離（圖1）。

圖1 蛋白鹽水解液分析色譜圖

    常規鹽酸水解氨基酸測定條件下，測氧化水解形成的蛋氨酸砜時，蛋氨酸砜和天冬氨酸不能分開（圖2）。

圖2 蛋白過氧化水解液分析色譜圖
注：本分析程序在蛋氨酸砜出峰完全后停止分析。

    蛋氨酸砜和天冬氨酸的分離決定于緩沖液B1的pH值。調整B1的pH值（減少檸檬酸鈉的用量），直到蛋氨酸砜和天冬氨酸分辨率為1.2以上（圖3），此時B1的pH值為3.0。

圖3 調整B1之pH值后的過氧化水解液色譜圖

    調整B1的pH值為3.0后，甘氨酸和丙氨酸分辨率下降，不能分開，根據儀器說明書，延長B1－B2切換時間，直到甘－丙氨酸分辨率在1.0以上，且確保其他氨基酸組分間分辨率均在1.0以上（圖4）。

圖4 調整B1-B2切換時間后的過氧化水解液色譜圖

    L-8900氨基酸分析儀采用前置式設計操作比較方便，打開前門可以進行緩沖液、反應液和分離柱的更換、廢液的處理及進行儀器的日常維護保養。反應試劑是在與氨基酸反應前才將兩種反應液R1、R2進行實時混合，有效的延長了反應液的使用期限、不需要額外的制冷裝置存放。在泵后、進樣器前連接了日立除氨柱，它能很好的排除氨的存在對于分析過程中對基線及峰形的干擾。系統內使用氮氣保護器對緩沖液進行隔離、對反應液進行保護、可防止氧化、延長反應液的使用時間以及避免由于氧氣進入緩沖液影響個別氨基酸的分析結果。試劑配方公開、可自行配制不需冷藏保存。
    在選定的色譜條件下，磺基丙氨酸和蛋氨酸砜的保留時間分別為1.39min和5.06min，保留時間的相對標準偏差小于1.58%。本檢測方法能有效地分離鑒定蛋氨酸和胱氨酸，目標峰與組織樣品中的其他峰分離良好。
    3.2 含硫氨基酸檢測準確性和回收率實驗
    3.2.1 檢測平行性
    同一批次兩次平行測定結果的相對偏差在1％以內，在允差（4％）范圍內。
    3.2.2 回收率的測定
    對檢測樣品進行加標回收率測試，結果顯示磺基丙氨酸和蛋氨酸砜峰面積加標回收率在93.02％～102.06％。

表1 回收率的測定

    從蛋氨酸和胱氨酸檢測的平行性和樣品的加標回收率可以看出，該檢測方法可靠，重復性良好，其準確度和精密度均符合檢測分析的要求。
    3.3 飼料和原料中的胱氨酸測定結果

表2 飼料和原料中的胱氨酸測定結果

    3.4 飼料和原料中蛋氨酸測定結果

表3 飼料和原料中蛋氨酸測定結果

    以上結果看出：氧化水解后，植物性蛋白質原料及飼料中蛋氨酸結果提高較多，動物性蛋白質原料及飼料中提高較少，可能與其結構有關。所以，只需對植物性蛋白原料及飼料進行過甲酸氧化水解，然后常規鹽酸水解樣品。

    4 結論
    采用過甲酸氧化水解法處理飼料及飼料原料樣品、通過日立L-8900氨基酸自動分析儀檢測樣品中的含硫氨基酸（蛋氨酸和胱氨酸），優化了氨基酸分析色譜條件，蛋氨酸和胱氨酸得到很好的峰形，與樣品中的其他峰分離良好，且結果重現性好，回收率高。
    對樣品進行氧化水解，能較準確測出樣品中蛋氨酸和胱氨酸含量，特別是對植物性蛋白質原料及飼料樣品，進行氧化水解比常規酸水解，檢測得出的蛋氨酸含量要高，對正確指導研發和生產工作具有重大意義。