磷由于其獨(dú)具的消化-吸收-代謝過程以及它在動(dòng)物營養(yǎng)中不可取代性及其在配合飼料中的重要作用，促使人們100多年來對它的研究從未間斷(霍啟光)。傳統(tǒng)的有關(guān)豬用飼料原料中磷的生物學(xué)效價(jià)概念一直都假定植物性飼料中有1/3的磷對單胃動(dòng)物具有生物學(xué)效價(jià)。因?yàn)橹参镄燥暳现杏?/SPAN>1/3的磷以非植酸磷形式存在，而其余2/3是以植酸磷形式存在。由于單胃動(dòng)物消化道缺乏植酸酶，通常假定植酸磷完全不能被單胃動(dòng)物利用；反之，非植酸磷則完全能被利用。越來越多的數(shù)據(jù)表明，豬用飼料原料磷的生物學(xué)效價(jià)變異很大。隨著動(dòng)物營養(yǎng)研究的不斷深入和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的不斷積累，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)，植物性飼料有效磷含量與飼料總磷、非植酸磷、植酸磷含量和植酸酶活性之間存在密切的相關(guān)關(guān)系(Rodehutscord等；Jongbloed)。以有效磷來確定飼料中磷的含量和動(dòng)物磷的需要量，是研究發(fā)展的必然趨勢。快速、準(zhǔn)確預(yù)測模型的建立有助于有效磷指標(biāo)在生產(chǎn)實(shí)際中的大量應(yīng)用，而模型的準(zhǔn)確性依賴于飼料原料中有效磷的準(zhǔn)確測定。目前有效磷的評定方法主要是采用斜率比法，通過測定被考查磷源相對于標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽差異而確定其相對生物學(xué)效價(jià)；或者通過平衡試驗(yàn)，直接測定磷的消化率(Jongbloed和Kemme)。方法雖然很多，但都存在著各自的局限性，其中以梯度回歸法的應(yīng)用最為廣泛，特別是二元梯度回歸法以其特有的優(yōu)勢成為了目前最具應(yīng)用潛力的評定方法，但其應(yīng)用條件和準(zhǔn)確性仍需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。此外，飼料有效磷的體外評定方法正日趨成熟，體外透析法中的胃蛋白酶+小腸液法表現(xiàn)出較好的可操作性。本文就豬用飼料原料有效磷評定方法的研究綜述如下。

1 豬用飼料原料有效磷體內(nèi)評定方法及存在問題

目前，豬用飼料原料磷的真消化率體內(nèi)評定方法有很多，基本可以分為以下幾種。

1.1 同位素稀釋技術(shù)

該方法的原理是，標(biāo)記的同位素³²P經(jīng)連續(xù)灌注，在體內(nèi)達(dá)到穩(wěn)衡狀態(tài)時(shí)，標(biāo)記有³²P的物質(zhì)在體內(nèi)各部分與未標(biāo)記的該物質(zhì)之比恒定，根據(jù)此關(guān)系，就可從標(biāo)記物和可測得的組分的量之比推算出不可測組分的量。

Whittemore和Thompson首次用³²P同位素稀釋技術(shù)測定了豬內(nèi)源磷和飼料有效磷的含量。但是同位素稀釋技術(shù)由于示蹤同位素在消化道內(nèi)循環(huán)速度快，這樣勢必造成高估內(nèi)源磷排泄量，另外此法受到多種條件限制，如需要放射性同位素實(shí)驗(yàn)室、訓(xùn)練有素的專門人員、放射性示蹤物處理難度大，成本高且存在安全性的問題，因此，至今難以廣泛應(yīng)用。

1.2 差量法

該方法是在Ammerman測定肉羊磷真消化率的方法上提出來的，基本方法是給動(dòng)物飼喂兩組不同磷水平日糧，前后兩次攝入量之差減去前后兩次糞磷之差，再除以前后兩次磷攝入量之差，就為磷的真消化率。

差量法的前提是前后兩次喂給動(dòng)物的磷源的消化率是相等的，或組成磷源的模式相同；同時(shí)內(nèi)源磷的排泄不受前后兩次攝入磷差異的影響。理論上將內(nèi)源磷排泄量分為最小內(nèi)源排泄量和可變內(nèi)源排泄量兩個(gè)部分。后者受飼養(yǎng)水平和日糧中Ca、P水平等因素的影響，而前者相對穩(wěn)定(Ammerman等)。但“最小”和“可變”兩個(gè)部分并沒有本質(zhì)區(qū)別，從量上的區(qū)分是可以通過對試驗(yàn)條件如日糧P水平、Ca/P等因素的控制實(shí)現(xiàn)的。前人的研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。Vemmer 和Oslage采用低磷日糧(TP，0.29%)進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源磷排泄量為糞磷的10%左右。Dellaertetal試驗(yàn)表明，日糧總磷含量在3～6g/kg之間，內(nèi)源磷排泄量變化不大，且不受日糧無機(jī)磷來源的影響。Fan等在對其試驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)源磷排泄量用g/kgDMI表示時(shí)，在0.11%～0.32%磷水平范圍，內(nèi)源磷的排泄量為0.23～0.32g/kgDMI, 理論上, 在一個(gè)很窄的P 水平區(qū)間變化, 飼料磷的真消化率是恒定的。方熱軍采用差量法, 分別以豆粕、次粉為唯一磷源, 設(shè)計(jì)了TP 水平為0.15%、0.20%、0.30%、0.35%梯度日糧, 按4×4拉丁方試驗(yàn), 測定了20 kg 生長豬內(nèi)源磷排泄量以及豆粕、次粉磷的真消化率。結(jié)果表明, 當(dāng)用g/kgDMI表示時(shí), 在0.15%～0.35%磷水平范圍, 動(dòng)物具有穩(wěn)定的內(nèi)源磷排泄量,糞磷的排泄量與日糧磷攝入量之間存在明顯的線性關(guān)系(P<0.05)。生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.65～0.68g/kgDMI, 次粉磷的真消化率顯著高于豆粕(P<0.01), 分別為63.7%和52.1%。因此, 從差量法計(jì)算的真消化率的變化也可以反映不同磷水平下內(nèi)源磷排泄增量相對于磷采食增量變化的程度, 從而判斷內(nèi)源磷排泄量的穩(wěn)定性。從差量法和REG 法的基本假設(shè)看, 二者并沒有本質(zhì)的區(qū)別, 因此, 通過對二者測定結(jié)果的比較, 也可以相互印證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

差量法存在以下缺點(diǎn): 兩種不同磷水平日糧, 磷含量都較少時(shí), 其差值就更小, 因此很容易引入誤差,并且相除以后會(huì)導(dǎo)致誤差的擴(kuò)大。

1.3 梯度回歸法

受梯度回歸法(Regression analysis technique，REG)評定內(nèi)源氨基酸方法的啟示，Fan和Shen等采用梯度回歸法測定了內(nèi)源磷排泄量。其基本假設(shè)是：消化道食糜或排泄物中磷的總流量與其攝入量之間呈線性關(guān)系，并假設(shè)日糧磷水平在一定范圍內(nèi)，其內(nèi)源磷的排泄量不隨磷攝入的變化而變化，此時(shí)外推至攝入量為零時(shí)磷的排泄量即為內(nèi)源磷排泄量。梯度回歸法能否用來準(zhǔn)確評定豬內(nèi)源磷排泄量及飼料磷的真消化率，關(guān)鍵要看其假設(shè)是否成立。

Jongbloed等、Dellaert等、蘇琪和余順祥的研究表明，在低于和接近實(shí)際需要量時(shí)，最小內(nèi)源磷排泄量小且相對穩(wěn)定，可變內(nèi)源排泄量部分可以趨向于零。因此，在內(nèi)源磷排泄量測定時(shí)，設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)娜占Z鈣、磷水平是關(guān)鍵。Rodehutscord等研究表明，在飼喂低磷日糧時(shí)，磷的攝入量與排泄量之間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系。Fan等提出并采用梯度回歸法研究了斷奶仔豬(5～20 kg)內(nèi)源磷的排泄，試驗(yàn)用豆粕作為唯一磷源，設(shè)計(jì)了0.11%、0.21%、0.32%和0.43%4個(gè)磷梯度的日糧，結(jié)果表明，當(dāng)糞磷的排泄量用“g/kgDMI”表示時(shí)，磷的排泄量與攝入量之間存在顯著的線性關(guān)系(r=0.87,，P<0.05)；由此測得仔豬回腸末端內(nèi)源磷排泄量為0.86g/kgDMI，顯著(P<0.05)高于全消化道內(nèi)源磷排泄量(0.31g/kgDMI); 但豆粕磷的回腸末端真消化率與全消化道真消化率之間差異不顯著(P>0.05)，分別為50.7%和48.5%。Shen等采用梯度回歸法，以玉米作為日糧的唯一磷源，分別設(shè)0.067%、0.146%、0.220%和0.283%4個(gè)磷梯度水平，研究了25kg生長豬內(nèi)源磷排泄量和玉米磷的真消化率，結(jié)果表明，磷的排泄量與攝入量之間存在顯著的線性關(guān)系(r=0.78， P<0.05)；生長豬回腸末端內(nèi)源磷排泄量為0.693g/kg, 全消化道內(nèi)源磷排泄量為0.67g/kgDMI, 二者差異不顯著(P>0.05); 玉米磷的回腸末端真消化率與全消化道真消化率之間差異也不顯著( P>0.05)，分別為54.0%和59.8%。方熱軍等采用梯度回歸法，以豆粕和次粉作為日糧磷唯一來源，分別設(shè)計(jì)了4組總磷水平為0.15% 、0.20%、0.30%、0.35%的梯度日糧，測定了20kg生長豬全消化道內(nèi)源磷排泄量和豆粕、次粉磷的全消化道真消化率。結(jié)果表明，在0.15%～0.35%總磷水平范圍內(nèi)，磷的排泄量與攝入量之間存在顯著的線性關(guān)系，動(dòng)物具有穩(wěn)定的內(nèi)源磷排泄量；不同飼料條件下梯度回歸法測定的內(nèi)源磷排泄量無顯著差異(P>0.05)，生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.65～0.68g/kgDMI；次粉磷的真消化率顯著高于豆粕(P<0.01)，分別為63.7%和52.1%。左建軍采用梯度回歸法，以待測原料和豆粕為磷唯一來源，分別設(shè)6個(gè)總磷水平，大麥-豆粕“模型”日糧為：0.09%、0.17%、0.26%、0.34%、0.43%、0.53%；高梁-豆粕“模型”日糧為0.08%、0.15%、0.23%、0.30%、0.38%、0.53%；花生粕-豆粕“模型”日糧為0.09%、0.17%、0.26%、0.35%、0.43%、0.53%；菜粕-豆粕“模型”日糧為0.11%、0.22%、0.33%、0.44%、0.55%、0.53%。其梯度范圍分別為0.95～5.85(大麥-豆粕“模型”日糧消化試驗(yàn))、1.08～5.85(高梁-豆粕“模型”日糧消化試驗(yàn))、1.12～5.85(花生粕-豆粕“模型”日糧消化試驗(yàn))和1.62～5.85g/kgDMI(菜粕-豆粕“模型”日糧消化試驗(yàn))。結(jié)果表明以大麥-豆粕為“模型”試驗(yàn)日糧測得生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.95 g/kgDMI，豆粕磷的真消化率為52.31%；以高梁-豆粕為“模型”試驗(yàn)日糧測得生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.29g/kgDMI，高梁和豆粕磷的真消化率分別為56.05%和39.41%；以花生粕-豆粕為“模型”日糧測得生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.53g/kgDMI，花生粕和豆粕磷的真消化率分別為28.00%和38.87%；以菜粕-豆粕為“模型”日糧測得生長豬內(nèi)源磷排泄量為0.21g/kgDMI，菜粕和豆粕磷的真消化率分別為10.21%和32.94%。其中，內(nèi)源磷排泄量因?yàn)樵囼?yàn)日糧“模型”不同，結(jié)果存在差異，但豆粕磷真消化率與前面幾位所取得的試驗(yàn)結(jié)果很好的吻合。由于梯度回歸法是在相對正常的飼養(yǎng)條件下測定的結(jié)果，它既克服了無磷日糧法的非正常生理?xiàng)l件下動(dòng)物的不適應(yīng)性，又避免了同位素稀釋技術(shù)所存在的安全隱患，是目前相對可靠的一種測定方法。但與梯度回歸法測定氨基酸內(nèi)源排泄量和真消化率類似，這種方法至少存在以下兩個(gè)方面不足：①假定內(nèi)源磷排泄量是恒值，不受日糧鈣、磷等因素的影響，顯然與事實(shí)不符；②日糧磷攝入量與糞磷排泄量之間有時(shí)不呈線性關(guān)系，因此無法按這種方法求得內(nèi)源磷的排泄量。針對這些缺點(diǎn)，可通過嚴(yán)格的試驗(yàn)條件控制來達(dá)到相對可靠的試驗(yàn)結(jié)果。現(xiàn)在常用的梯度回歸法可以分為一元梯度回歸法和二元梯度回歸法，下面分別說明。

1.3.1 一元梯度回歸法

此方法是近年來Fan等借鑒測定內(nèi)源氨基酸方法提出的。該方法的基本前提假設(shè)是：日糧磷水平在一定范圍內(nèi)，其內(nèi)源磷排泄量和真消化率不隨磷食入量的變化而變化；日糧表觀可消化磷的量(g/kgDMI)與其攝入量之間呈線性關(guān)系，此時(shí)外推至攝入量為零時(shí)，日糧表觀可消化磷的量(即回歸截距)即為內(nèi)源磷排泄量，再根據(jù)公式計(jì)算磷的真消化率。先后又有Shen、Ajakaiy、方熱軍、張艷玲用一元線性梯度回歸法，分別估測了不同生長階段豬對多種植物飼料磷的真消化率和內(nèi)源排泄量，并都取得了較滿意的結(jié)果。但前人的研究主要是對單一植物飼料豆粕、玉米等組成的半純合日糧作一元線性回歸，而對于菜粕、花生粕等飼料，由于抗?fàn)I養(yǎng)因子含量較多、適口性差，如采用一元回歸法，會(huì)引起動(dòng)物采食量和生產(chǎn)性能下降、消化機(jī)能紊亂等有害作用, 這樣會(huì)嚴(yán)重影響回歸法估測的真消化率的可靠性。其估測日糧內(nèi)源磷和飼料磷真消化率一元回歸公式如下：

NA_i=ND_i×DA_i

NA_i=-NE+[(DT_i/100)×ND_i]

式中：NE——糞中所含的內(nèi)源P排泄量(g/kgDMI)；

NA_i——第i組日糧表觀可消化P含量(g/kgDMI)；

ND_i——第i組日糧P的含量(g/kgDM)；

DA_i——第i組日糧總P表觀消化率(%)；

DT_i——第i組日糧中基礎(chǔ)飼料、待測飼料P真消化率(%)；

ND_i——第i組日糧中基礎(chǔ)飼料、待測飼料P的含量(g/kgDMI)。

1.3.2 二元梯度回歸法

此方法是在一元回歸法的基礎(chǔ)上建立起來的，它的基本假設(shè)同一元回歸法，但是需要在簡單線性回歸的基礎(chǔ)上增加一個(gè)假設(shè)，即日糧中待測原料和基礎(chǔ)原料消化率之間存在可加性。二元回歸法既可克服一元回歸法的局限性，又可同時(shí)測定兩種飼料磷的真消化率。巫徑、祝曉燕首次嘗試性的以豆粕為基礎(chǔ)日糧，分別以用菜籽粕、棉籽粕等比例替代豆粕，用二元線性回歸法來預(yù)測菜籽粕、棉籽粕磷的內(nèi)源排泄量和真消化率。結(jié)果表明：混合日糧的表觀可消化磷量(g/kgDMI)與攝入磷的量(g/kgDMI)之間存在顯著的線性關(guān)系，采用二元線性回歸法測定混合日糧中菜粕和豆粕、棉籽粕和豆粕磷真消化率的基本假設(shè)成立。此后，左建軍選用非常規(guī)飼料原料——花生粕結(jié)合豆粕配制試驗(yàn)日糧，通過二元梯度回歸法測定生長豬內(nèi)源磷及鈣排泄量以及花生粕磷的真消化率。結(jié)果表明：在接近磷需要量水平范圍內(nèi)，糞磷的排泄量(以g/kgDMI為計(jì)量單位)與磷的攝入量之間存在顯著的線性關(guān)系，內(nèi)源磷排泄量基本穩(wěn)定，基礎(chǔ)原料和待測原料之間具有可加性。因此，二元線性回歸法可以有效測定生長豬內(nèi)源磷排泄量和飼料磷真消化率。估測日糧內(nèi)源磷和飼料磷真消化率二元回歸公式如下：

NA_i=ND_i×DA_i

NA_i=-NE+[(DT₁/100)×N₁D_i]+[(DT₂/100)×N₂D_i]

式中：NE——糞中所含的內(nèi)源P排泄量(g/kgDMI)；

NA_i——第i組日糧表觀可消化P含量(g/kgDMI)；

ND_i——第i組日糧P的含量(g/kgDM)；

DA_i——第i組日糧總P表觀消化率(%)；

DT₁、DT₂——第i組日糧中基礎(chǔ)飼料、待測飼料P真消化率(%)；

N₁D_i、N₂D_i——第i組日糧中基礎(chǔ)飼料、待測飼料P的含最(g/kgDMI)。

2 豬用飼料原料有效磷體外評定方法及存在問題

體外法不需要試驗(yàn)動(dòng)物的參與。自從Sheffer等首次采用胃蛋白酶進(jìn)行體外評定飼料蛋白質(zhì)消化率作為飼料體外消化技術(shù)的開端，到現(xiàn)在已經(jīng)有50多年的歷史了。體外法主要包括溶解度法和體外模擬法。溶解度法是根據(jù)被測物質(zhì)的理化特性，考察其溶解度與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系，主要用于無機(jī)鹽的效價(jià)評定。體外模擬法是利用實(shí)驗(yàn)室方法模擬動(dòng)物體內(nèi)消化環(huán)境將樣品消化，然后計(jì)算樣品內(nèi)所測營養(yǎng)物質(zhì)消化率的方法，其中以體外透析袋法最為成熟。比較而言，體外模擬法是人工模擬體內(nèi)消化條件，具有更好的理論基礎(chǔ)和實(shí)際效果。特別是透析袋法在模擬體內(nèi)消化過程的同時(shí)，還模擬了體內(nèi)吸收過程，具有更好的可操作性、可重復(fù)性和精確性(Galibois等；Drake等；黃瑞林)。此外，體外模擬法中的外翻腸囊法以其操作簡單、快速，能詳細(xì)地觀察到元素進(jìn)出腸段的變化優(yōu)勢，也越來越受到重視。

2.1 體外法在應(yīng)用中需要注意的事項(xiàng)

席鵬彬總結(jié)出體外法在應(yīng)用中需要注意以下幾點(diǎn)：①體外消化測定方法中所采用的酶制劑種類及組合方式應(yīng)盡可能與體內(nèi)消化反應(yīng)保持一致，以便更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)消化過程。②酶與底物的濃度比、酶的特異性以及酶的活性也應(yīng)該與體內(nèi)保持一致。③培養(yǎng)溫度和pH值需要調(diào)整到與體內(nèi)一致的水平。④酶的濃度以及孵育時(shí)間應(yīng)隨所模擬體內(nèi)條件進(jìn)行調(diào)整，使之盡可能接近體內(nèi)條件。⑤為避免可能存在的消化產(chǎn)物對酶促反應(yīng)的抑制作用，消化終產(chǎn)物應(yīng)盡快與未消化物質(zhì)分離。⑥應(yīng)注意樣品重量和粒度對體外消化率的影響。

2.2 外翻腸囊法的介紹

外翻腸囊法是在體外培養(yǎng)腸環(huán)法的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，屬于體外評定方法，基本原理就是從活體取出小腸分割成不同的腸段，將各腸段外翻成囊狀，放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時(shí)間后，放進(jìn)裝有被測物的燒瓶中，觀測腸道粘膜、漿膜及囊中被測物的變化。通過測定腸囊中被測物質(zhì)的變化，了解其吸收情況(Willson和Wiseman)。

Manls和Sehaehter首次用外翻腸囊技術(shù)測定了小腸對鐵的吸收。同年，他又用此技術(shù)研究了給鐵方式和懷孕對大鼠鐵吸收的影響，從而使外翻腸囊技術(shù)結(jié)合同位素示蹤技術(shù)在鐵的研究中成熟起來。Evans采用外翻腸囊法研究了大鼠小腸鋅最大吸收部位。Seal等利用大鼠十二指腸和回腸的外翻腸囊研究有機(jī)配位體對鋅吸收的影響，他們認(rèn)為外翻腸囊法是研究影響鋅吸收的物質(zhì)的有效手段。Sankar用外翻腸囊法研究了阿司匹林和尼美舒利對D葡萄糖運(yùn)輸和二糖水解酶的影響，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。國內(nèi)有陳穎等利用翻轉(zhuǎn)小腸囊法研究了環(huán)孢素A口服納米脂質(zhì)體在大鼠小腸的吸收行為；計(jì)峰等用外翻腸囊法研究了有機(jī)錳在肉仔雞小腸中的吸收特點(diǎn)。李昊等使用大鼠腸管外翻模型對人參皂苷Rgl吸收機(jī)制進(jìn)行研究，他們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，外翻腸囊法是一種可行的體外評定方法。那么，應(yīng)用此方法測定磷的吸收應(yīng)該同樣具有相當(dāng)?shù)目刹僮餍?/SPAN>，至于具體操作需要驗(yàn)證。

該方法操作簡單、快速，能詳細(xì)地觀察到元素進(jìn)出腸段的變化。但該方法是在沒有血液供應(yīng)的非正常生理?xiàng)l件下進(jìn)行的，粘膜沒有營養(yǎng)供應(yīng)，其功能未必能完全發(fā)揮，而且粘膜攝入的元素也無法通過循環(huán)血液進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。這些制約因素使得此方法僅適合于初步判斷和篩選生物學(xué)活性更高的化合物，對其結(jié)果在實(shí)際中的應(yīng)用還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 體外消化技術(shù)評定豬用飼料原料有效磷的研究進(jìn)展

根據(jù)原理和裝置不同可將體外消化測定技術(shù)分為：密閉系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)后未消化殘?jiān)鼫y定技術(shù)、培養(yǎng)過程中已經(jīng)消化物質(zhì)的透析技術(shù)和培養(yǎng)過程中的pH值測定技術(shù)。此外，根據(jù)體外消化處理的步驟和處理酶系的不同，又可把體外評定法分為單酶體系培養(yǎng)法和多酶體系培養(yǎng)法，其中單酶體系培養(yǎng)法包括胃蛋白酶培養(yǎng)法和胰蛋白酶培養(yǎng)法，多酶體系培養(yǎng)法包括小腸液一步體系培養(yǎng)法、胃蛋白酶+胰蛋白酶二步體系培養(yǎng)法、胃液+小腸液兩步消化法、胃蛋白酶+胰蛋白酶+纖維降解酶三步體系培養(yǎng)法等。

Sheffer等首次采用胃蛋白酶進(jìn)行一步體外培養(yǎng)，此后許多研究者采用其它蛋白酶進(jìn)行簡單的體外培養(yǎng)技術(shù)，如胰蛋白酶(Maga等)、木瓜蛋白酶(Buchanan)、鏈霉蛋白酶(Taverner等)和凝乳酶(Bhatty)。由上可知單酶體系的主要特點(diǎn)是體外培養(yǎng)采用的酶制劑均是單一酶制劑。與單胃動(dòng)物消化道內(nèi)的復(fù)雜消化過程相比較，采用單酶體系模擬動(dòng)物體內(nèi)的消化過程過于簡單。此外飼料某種養(yǎng)分的消化通常受其它養(yǎng)分降解影響，所以為了更好地模擬體內(nèi)消化過程，更準(zhǔn)確估測體內(nèi)消化率，體外消化測定技術(shù)必須盡可能地將影響動(dòng)物體內(nèi)消化的因素考慮進(jìn)去。多酶體系則能更準(zhǔn)確地模擬動(dòng)物體內(nèi)消化過程，且可以充分考慮飼料中各種養(yǎng)分間的相互影響作用，是一種較為理想的體外消化測定技術(shù)。多酶體系最早使用小腸液模擬小腸進(jìn)行體外培養(yǎng)(Goering和Van Soest；Lowgren等)，可用于估測豬小腸淀粉、粗蛋白的利用效率以及日糧纖維的降解率，也可比較豬飼料營養(yǎng)價(jià)值。之后，Buchmann發(fā)現(xiàn)先用胃蛋白酶培養(yǎng)，再用胰酶制劑代替小腸液進(jìn)行體外培養(yǎng)也可估測小鼠蛋白質(zhì)糞真消化率。Dierick等比較研究了采用小腸液和胰酶制劑對體外培養(yǎng)效果的影響，結(jié)果表明用胰酶制劑可代替豬小腸液來估測干物質(zhì)和粗蛋白回腸消化率和糞消化率，且準(zhǔn)確度無任何變化。盡管采用二步體外培養(yǎng)體系獲得的消化率估測值與全消化道消化率測定值具有一定的相關(guān)性，但它僅能模擬豬前消化道(胃和小腸)的降解過程，因此豬日糧中部分有機(jī)物質(zhì)的降解未被考慮進(jìn)去，特別是日糧纖維可能被后腸微生物發(fā)酵降解的部分都被忽略了。就這一問題，Vervaeke等做了進(jìn)一步的研究，將飼料樣品先經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶連續(xù)培養(yǎng)后，再用瘤胃液進(jìn)行培養(yǎng)，以模擬胃、小腸、大腸不同消化道部位的消化過程。瘤胃內(nèi)微生物群落與豬后腸內(nèi)微生物群落非常相似(Fonty和Gouet)，因此用瘤胃液進(jìn)行體外孵育可以模擬豬后腸微生物發(fā)酵過程，可準(zhǔn)確預(yù)測養(yǎng)分在后腸內(nèi)的降解過程。上述方法都是在密閉的系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行的，所以又稱為密閉系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)后未消化殘?jiān)鼫y定技術(shù)。在密閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行體外酶消化過程中，隨消化時(shí)間延長，消化產(chǎn)物的不斷積累會(huì)對酶消化過程產(chǎn)生抑制作用(Robbin)。采用能截留一定分子量大小的透析袋體外消化技術(shù)可以將消化產(chǎn)物連續(xù)除去，就如被小腸吸收一般，從而消除產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，因此，與其它體外消化測定技術(shù)相比，透析法能更準(zhǔn)確地模擬豬小腸內(nèi)的動(dòng)態(tài)消化吸收過程。Gauthier等采用胃蛋白酶+胰蛋白酶兩步酶解法，進(jìn)一步發(fā)展了透析體外測定技術(shù)，該方法先在燒杯中用胃蛋白酶進(jìn)行孵育(pH值1.9，30min)，然后將反應(yīng)混合液pH值調(diào)至中性后轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)(截流分子量為1000Da)，再加入胰酶制劑進(jìn)行體外培養(yǎng)(pH值8.0，24 h)。有關(guān)飼料鈣和磷的體外消化研究的報(bào)道不多。最初，Wolter等對飼料磷的利用率進(jìn)行了體外評定，獲得了滿意結(jié)果。Zyla，等體外模擬火雞的嗉囊、肌胃和腸道的生理?xiàng)l件，測定了添加不同的植酸酶時(shí)玉米-豆粕日糧磷的有效率，結(jié)果表明體外消化對植酸磷中無機(jī)磷的釋放量與動(dòng)物生產(chǎn)性能(R2=0.986)和趾骨灰分含量(R2=0.952)存在顯著相關(guān)。之后，Liu等在Zyla等研究基礎(chǔ)上，研究了用體外透析法評定豬飼料有效磷的適宜條件，結(jié)果表明，1g玉米-豆粕型日糧在胃蛋白酶濃度3000U/ml、pH值2.5條件下培養(yǎng)75min后，再在pH值6.0條件下經(jīng)胰蛋白酶消化4h，測定透析液中磷的濃度，測定的磷透析率與磷消化率之間存在高度相關(guān)(r=0.999)。

由此可見，體外透析技術(shù)對飼料磷有效率的評定是可行的。體外消化測定技術(shù)經(jīng)過50年歷史已有了很大發(fā)展，目前已存在許多測定方法。總的發(fā)展方向是：由簡單向復(fù)雜發(fā)展、由單酶向多酶發(fā)展、由密閉靜態(tài)培養(yǎng)體系向動(dòng)態(tài)透析培養(yǎng)體系發(fā)展、由動(dòng)物消化液如小腸液和瘤胃液向商品酶制劑(胰酶制劑和微生物纖維降解酶)發(fā)展。

體外法的關(guān)鍵之處在于所使用的酶應(yīng)該與所模擬的消化道內(nèi)存在的酶相同，所以，理論上選用來源于動(dòng)物自身消化道內(nèi)容物提取物(如胃液、小腸液)進(jìn)行體外的消化測定應(yīng)該可以獲得最準(zhǔn)確、最可靠，與體內(nèi)結(jié)果最為接近的試驗(yàn)結(jié)果。然而動(dòng)物內(nèi)容物的獲得及標(biāo)準(zhǔn)化要比商業(yè)用酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)困難的多。因此，采用商品試劑酶結(jié)合動(dòng)物消化道內(nèi)容物的方法也是一個(gè)可取的體外評定方法。Furuya等提出分別用胃蛋白酶和豬的空腸液連續(xù)消化的兩步法，用于模擬豬體內(nèi)發(fā)生于胃和小腸的消化反應(yīng)，測得的粗蛋白體外消化率與豬的糞蛋白表觀消化率有良好的相關(guān)。在國內(nèi)，張子儀也對該方法進(jìn)行了系統(tǒng)報(bào)道，特別是肯定了小腸液體外消化處理技術(shù)在評定飼料能量和蛋白消化率方面具有很好重演性和可靠性。

體外法能否作為評定飼料有效磷的有效方法，要看其結(jié)果能否反映體內(nèi)測定的結(jié)果。Liu等測定結(jié)果的相關(guān)水平(r=0.72～0.76)、方熱軍測定結(jié)果的相關(guān)水平(r=0.75)和左建軍的研究結(jié)果(體外透析率與真消化率值之間相關(guān)性分別是：胃蛋白酶+胰蛋白酶兩步法測定與體內(nèi)真消化率具有r=0.71的較強(qiáng)相關(guān)性，胃液+小腸液兩步法與體內(nèi)真消化率具有r=0.79的較強(qiáng)相關(guān)性，胃蛋白酶+小腸液兩步法與體內(nèi)真消化率具有r=0.80的較強(qiáng)相關(guān)性)具有較高的吻合性。由此來看，體外透析的有效磷評定方法是可以反映體內(nèi)磷消化結(jié)果的有效評定飼料磷有效率的方法。三者具體的體外磷透析率結(jié)果比較見表1。

表1 體外磷透析率結(jié)果比較(%)

另外, 植物性飼料磷可利用率與磷的體外可消化率、飼料中總磷和植酸磷含量、植酸酶的活性有顯著的相關(guān)性(蘇琪等；孫長春等；Liu等；賈剛等；方熱軍；左建軍)。

由于表觀消化率的變異較大，真消化率具有相對穩(wěn)定性，體外可透析磷對真可消化磷建立的預(yù)測模型具有相對較高的擬合度和可靠性。體外法直接意義在于比較飼料之間的磷可利用的趨勢大小，而不是在其絕對值本身，但通過大量體內(nèi)、體外試驗(yàn)資料的積累，就可以建立相應(yīng)的預(yù)測模型(Wolter等)。Pointillart等、Oksbjerg、Bosi等、Liu等、方熱軍以及左建軍先后進(jìn)行了飼料磷體外透析率的研究，并建立了相應(yīng)的有效磷預(yù)測模型，證實(shí)了通過體外可透析磷預(yù)測有效磷的可行性。其中，以方熱軍建立的預(yù)測模型y=0.542+1.017x(R2=0.90，P<0.01)和左建軍的胃液+小腸液兩步法、胃蛋白酶+小腸液兩步法測定的飼料可透析磷對表觀可消化磷的預(yù)測模型(見表2)決定系數(shù)R²都達(dá)到了0.92，具有較好的擬合度和估測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 可透析磷對表觀可消化磷的預(yù)測模型(n=28)

注: y 為飼料表觀可消化磷含量, x 為飼料可透析磷含量。