關鍵詞：飼料；己烯雌酚；高效液相色譜—串聯質譜
己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES） 化學名為1，2-雙（4-羥苯基）-1，2-二乙基乙烯，俗名乙底酚，是一種人工合成的二苯乙烯類雌性激素，由于其具有促進動物生長、增加蛋白質沉積和提高飼料轉化率的作用，曾經作為促生長劑廣泛應用于畜牧養殖業。人長期食用殘留有己烯雌酚的產品體內激素平衡將被擾亂，導致婦女的更年期紊亂、女童性早熟、男性女性化、生育能力降低，并誘發女性乳腺癌、卵巢癌等疾病。因此，世界上絕大多數國家禁止在食品動物中使用DES，2002年我國農業部規定DES禁止在飼料中使用，2003年農業部規定DES在可食性動物組織中不得檢出。本文采用外標法定量，建立了飼料中己烯雌酚的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，該方法適用于配合飼料和預混料中己烯雌酚的檢測。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器
超高效液相色譜—串聯質譜聯用儀（UPLC Quattro Premier），美國Waters 公司。
1.1.2 色譜條件
色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1mm×50mm 1.7μm；流動相為乙腈—水（50：50，v/v），流速0.2mL/min；進樣體積10μL；柱溫35℃。
1.1.3 質譜條件
離子源ESI（電噴霧離子源），掃描方式負離子掃描，檢測方式MRM（多反應監測），離子源溫度110℃，霧化氣溫度350℃，毛細管電壓3.5kV，錐孔電壓25v。
1.1.4 試劑
己烯雌酚標準品，含量99.0%，批號60518，購自德國Dr. Ehrenstorfer。甲醇為色譜純。水為超純水，用美國MILLIPORE超純水儀自制。
1.2 實驗方法
1.2.1 標準溶液貯備液（1mg/mL）的配制
準確稱取0.025g己烯雌酚標準品，置于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分搖勻，配制成1mg/mL的標準貯備液，密封，-20℃保存。
1.2.2 標準工作溶液（50μg/mL）的配制
用移液器取5mL貯備液（1mg/mL）于100mL容量瓶中，用甲醇定容，得到50μg/mL的標準工作液，密封，4℃保存備用。
1.2.3 標準曲線的繪制
分別準確吸取一定量的標準工作溶液（50μg/mL），用流動相稀釋成0.1、1、10、50、100、500ng/mL的標準溶液，分別進樣10μL，得峰面積。以己烯雌酚特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，采用外標法定量。
1.2.4 樣品前處理
稱取2.0g飼料樣品置于50mL聚丙烯離心管中，加入2mL蒸餾水，待飼料浸潤后再加入18mL甲醇，渦旋混勻1min，震蕩10min，6 000r/min離心5min，取上清液，加入20mL正己烷，渦旋，震蕩10min，6 000r/min離心5min，取下層液體，過0.20μm濾膜過濾后供高效液相色譜—串聯質譜法測定，上機前用50%甲醇溶液10倍稀釋。
1.2.5 添加回收率和精密度的測定
稱取空白飼料2.0g置于50mL聚丙烯離心管中，設0.1、5、20mg/kg 3個添加水平，每個濃度做5個平行，按1.2.4方法處理，取10μL進樣分析，每個濃度重復進樣3次。根據峰面積計算添加回收率和日內變異系數，連續做3d，計算日間變異系數。
1.2.6 靈敏度的測定
取空白飼料做10個平行，按照1.2.4方法處理，測得基線噪音值，并求其平均值。按照信噪比S/N=3確定為檢測限（LOD），S/N=10（LOQ）確定為定量限。
2 結果與討論
2.1 方法的線性范圍
己烯雌酚濃度在0.1～500μg/L范圍內，線性關系良好，線性方程為y=537.21x-104.47，相關系數r=0.9995（圖1）。
圖1 己烯雌酚標準溶液的工作曲線
2.2 回收率和精密度的確定
添加回收率和變異系數見表1。結果表明，在相應的保留時間內空白飼料對被測藥物無任何干擾，本方法適用于飼料中己烯雌酚殘留的檢測。
表1 飼料中己烯雌酚添加回收結果
|
藥物 |
添加濃度/（mg/kg） |
回收率/% |
日內RSD（%）/（n=5） |
日間RSD（%）/（n=3） |
|
己烯雌酚 |
0.1 |
75.2±3.23 |
4.3 |
8.6 |
|
5 |
84.2±2.03 |
2.4 |
5.5 | |
|
20 |
97.6±1.07 |
1.1 |
3.8 |
2.3 靈敏度
傳統的液質聯用流速較大、半峰寬較寬，導致色譜峰擴散、液質聯用靈敏度降低，液相成為質譜靈敏度提高的瓶頸。近年來出現了基于小顆粒技術的超高效液相色譜（UPLC）技術，與傳統的液相相比具有更高的分離能力、更快的分析速度，其流速小、半峰寬較窄、色譜峰擴散小，從而使液質聯用靈敏度得到了極大地提高。該方法測定己烯雌酚在飼料中的檢測限為10μg/kg，定量限20μg/kg。
2.4 己烯雌酚的質譜條件優化
己烯雌酚由于其化學結構中羥基、酰氨鍵的存在，具有很強的極性，在負離子模式下有較高的響應。故在負離子模式下進行全掃描，以乙腈-水（50:50，V/V）為流動相，采用流動注射泵連續進樣，對己烯雌酚的質譜條件進行優化，以選擇準分子離子峰（[M-H]-）和電離方式。根據己烯雌酚的響應和保留時間差異，設置了1個通道進行監測。結合基質空白和基質標準液的離子掃描圖，優化參數，從而相應地確定了在多反應監測模式下信號采集的特征離子對，優化后的離子質譜參數見表2。
表2 己烯雌酚質譜參數
|
藥物 |
定性離子對/（m/z） |
定量離子對/（m/z） |
Dwell（secs） |
碰撞能量/eV |
錐孔電壓/V |
|
己烯雌酚 |
|
320.90>151.85 |
0.15 |
18 |
35 |
|
320.90>256.92 |
|
0.15 |
11 |
35 | |
|
320.90>193.90 |
|
0.15 |
13 |
35 |
圖2 己烯雌酚標準品（0.1μg/L）特征離子質量色譜圖 （A）、空白飼料己烯雌酚特征
離子質量色譜圖（B）、飼料中添加己烯雌酚（0.1mg/kg）特征離子質量色譜圖（C）
2.5 飼料樣品前處理條件優化
關于己烯雌酚飼料樣品前處理的方法的報道，主要采用乙酸乙酯、甲醇和乙腈等作為提取溶劑，提取后過C18柱凈化，該類方法費時，而且回收率也很低。而且采用乙酸乙酯作為提取溶劑，本底較高。2007年頒布的國標飼料中高效液相色譜-串聯質譜檢測方法前處理使用了液液分配凈化和固相萃取柱凈化，方法繁瑣、回收率低、重復性差。本文采用甲醇提取，正己烷脫脂，有效去除了雜質干擾，前處理簡單、快速、經濟。己烯雌酚標準品、空白飼料、空白添加樣品的特征離子質量色譜圖見圖2，由其可知，樣品的雜質峰較少，己烯雌酚峰形良好。
3 結論
該方法分析飼料中的己烯雌酚，前處理方法操作簡便、快速、凈化效果好，可同時定性和定量，方法的回收率、重復性、檢測限均能滿足飼料中己烯雌酚殘留檢測的要求。
（參考文獻略）
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