【摘要】建立了高效液相色譜？串聯質譜（HPLC?MS/MS）測定豬肉樣品中新型獸藥泰拉霉素殘留的方法。樣品用V（甲醇）∶V（0.1%H3PO4）=70∶30混合溶液提取，經離心后用PCX固相萃取小柱凈化，以Symmetry?C8色譜柱為分離柱，在串聯質譜多反應監測（MRM）模式下檢測，內標法定量。方法的線性范圍為10~500 g/kg,檢出限為5.0 g/kg,在3個濃度水平（10,20和50 g/kg）進行添加實驗，平均回收率為93.1%~105.5%;批內相對標準偏差為1.5%~4.6%;批間相對標準偏差為1.8%~5.6%.

　　【關鍵詞】高效液相色譜？串聯質譜，豬肉，泰拉霉素，殘留

　　1引言

　　泰拉霉素（Tulathromycin）是一種新近上市且為動物專用的大環內酯類半合成抗生素，分子式為C41H79N3O12（分子量806），其分子結構如圖1所示。我國農業部在2008年第957號公告中首次批準使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統疾病。具有用量少、一次給藥、低殘留、動物專用等優點[1,2].我國廣泛使用的大環內酯類藥物為泰樂菌素和替米考星，雖然這兩種藥物的使用效果良好，但隨著使用時間的延長，圖1泰拉霉素分子結構式

　　Fig.1Structureoftulathromycin在很多地區出現了不同程度的耐藥性[3],而泰拉霉素藥效強于泰樂菌素、替米考星和氟苯尼考等市場廣泛使用的大環內酯類藥物，因此，泰拉霉素必將在畜禽生產中大量使用。作為一種新藥，泰拉霉素的殘留檢測方法的研究尤為必要。目前，大環內酯類藥物殘留檢測方法有ELISA篩選法[4]、薄層色譜法[5]、氣質聯用法[6]、高效液相色譜[7~10]和高效液相色譜串聯質譜法等[11,12].有關泰拉霉素的殘留檢測研究較少[13].本研究建立了以羅紅霉素（C41H76N2O15,837）為內標的泰拉霉素的HPLC?MS/MS檢測方法，方法的定量限為10 g/kg,可以滿足有關法規對大環內酯類藥物的檢測要求，為動物組織中泰拉霉素的殘留監控提供技術支持。

　　2實驗部分

　　2.1儀器與試劑

　　Waters2695QuattroMicroTMAPI高效液相色譜串聯質譜儀（美國Waters公司）；固相萃取儀（美國Supelco公司）；PCX固相萃取柱（3mL,60mg,Agela公司）；T25B組織勻漿機（德國Ika公司）；RE120旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；MS1Minishaker旋渦混合器；E?EVAP水浴氮氣吹干儀（美國Organomation公司）；超純水器（美國Milli?Q公司）。

　　泰拉霉素標準品與羅紅霉素內標（Sigma公司）、乙腈、甲醇、H3PO4為色譜純；甲酸、KH2PO4、NH3.H2O為分析純；實驗室用水為Milli?Q高純水。

　　2.2標準溶液的配制

　　泰拉霉素標準儲備液：準確稱取泰拉霉素10.0mg,用V（0.05mol/LK2HPO4）∶V（乙腈）=75∶25（pH6.0）定容至10mL,搖勻，置冰箱冷藏儲存，有效期3個月。內標物羅紅霉素的配制方法同泰拉霉素。

　　添加溶液的配制：吸取儲備液1mL于100mL容量瓶中并用V（0.05mol/LK2HPO4）∶V（乙腈）=75∶25（pH6.0）混合液定容，再從中吸取1mL于50mL容量瓶中得添加液濃度為0.2mg/L（冰箱冷藏儲存，有效期2個月）。

　　2.3內標物質的確定

　　由于大環內酯類藥物的同位素內標物質很少，至今無泰拉霉素同位素內標物出售。而測定大環內酯類藥物的檢測方法研究和標準修制訂一般采用外標法或者采用大環內酯類某種結構相似藥物作為內標物來進行定量分析。本實驗選用一種沒有用于獸藥用途且結構與泰拉霉素非常相似的大環內酯類藥物羅紅霉素作為內標，分子結構如圖2所示。圖2內標物羅紅霉素分子結構式

　　Fig.2Structureofroxithromycinasinternalstandard

　　2.4供試樣品溶液的制備

　　稱取2.0g組織樣品于50mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL提取液（V（甲醇）∶V（0.1%H3PO4）=70∶30）和適量內標工作液，7800r/min勻質1min后，5000r/min離心2min,收集上清液過已經分別用3mL甲醇和3mL提取液潤洗過的60g/3L的PCX小柱，待全部過柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%氨化甲醇洗脫，50℃水浴氮氣吹干后用1mL流動相定容，進行HPLC?MS/MS分析。

　　2.5LC?MS/MS分析條件

　　Symmetry?C8柱（20mm 3.9mm,5 m），流動相：V（乙腈）∶V（0.1%甲酸水溶液）=70∶30;柱溫：30℃，進樣室溫度15℃，進樣量：10 L,流速為0.3mL/min.

　　ESI（ ）；多級反應檢測（MRM）；毛細管電壓：4.2kV;錐孔電壓：20V;RF透鏡電壓：0.2V;離子源溫度：110℃；脫溶劑氣溫度：350℃；錐孔氣流速：50L/h;脫溶劑氣流速：600L/h;倍增器電壓：650V;二級碰撞氣：氬氣。

　　3結果與討論

　　3.1樣品的提取和凈化

　　泰拉霉素含3個堿性的氨基基團，為弱堿性化合物，易溶于酸性溶液和極性溶劑中，在pH6~8的水溶液中較穩定，在酸性（pH<4）和堿性（pH>9）條件下均不穩定。對泰拉霉素殘留的提取和凈化方法的設計主要依據其弱堿性、脂溶性和酸不穩定性。據文獻[3]報道，乙腈和甲醇是組織中大環內酯類藥物常用的提取溶劑，且采用酸化的乙腈或甲醇為提取溶劑可促進大環內酯類抗生素從組織中溶出，改善提取效率。本實驗比較了4種提取液：乙腈？0.1%偏磷酸（70∶30,V/V）、甲醇？0.1%偏磷酸（70∶30,V/V）、乙腈？0.1%磷酸（70∶30,V/V）和甲醇？0.1%磷酸（70∶30,V/V）對泰拉霉素的提取效果。結果表明，甲醇？0.1%磷酸（70∶30,V/V）提取液對泰拉霉素的提取效果較好，回收率高于其它提取液，故本實驗選擇甲醇？0.1%磷酸（70∶30）為樣品提取液。液？液分配（LLE）和固相萃取（SPE）是大環內酯類藥物的兩種主要凈化手段。液？液分配操作比較麻煩且回收率相對較低，重復性較差，所以本研究采用固相萃取技術凈化。比較了C18、OasisMCX和PCX3種SPE凈化小柱，由于OasisMCX小柱和PCX小柱兼有陽離子交換和疏水作用機制，基于泰拉霉素的弱堿性和脂溶性的理化特性，OasisMCX小柱和PCX小柱的凈化效果優于C18小柱。OasisMCX小柱和PCX小柱提取效率沒有明顯差別，但PCX小柱成本低，所以，本方法選擇PCX小柱。

　　3.2色譜與質譜條件的優化

　　3.2.1液相色譜條件的優化泰拉霉素是弱堿性和脂溶性的極性化合物，通過選擇不同規格、不同填料的色譜柱和調節流動相中緩沖溶液的pH值、離子強度和有機溶劑（如乙腈或甲醇）的含量，從而控制泰拉霉素的離子化強度和溶解性，使其在色譜柱上獲得適當的保留和有效的分離。本實驗選用了Symmetry?C8柱（20mm 3.9mm,5 m），VenusilASBC18柱（30mm 2.1mm,5 m），XTerraMSC18柱（15mm 2.1mm,3.5 m）和XDB?C18柱（50mm 1.0mm,5 m）4種不同規格、不同填料的色譜柱進行實驗。結果發現，選用Symmetry?C8色譜柱時，基線平穩，峰形對稱，重現性好。流動相優化實驗發現，當流動相為V（乙腈）∶V（0.1%甲酸水溶液）=70∶30等度洗脫時，可使泰拉霉素在Symmetry?C8色譜柱上得到較好的分離效果和較高的靈敏度。

　　3.2.2質譜條件的優化根據泰拉霉素的分子結構的特征，選擇了ESI（ ）為電離模式。通過流動注射直接進樣，對毛細管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、RF透鏡電壓、質譜分辨率等條件進行了優化，并最終確定本方法質譜優化條件為：毛細管電壓4.2kV,錐孔電壓20V,RF透鏡電壓0.2V,離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量600L/h.質譜圖見圖3,母離子、子離子以及定性、定量離子對見表1.表1泰拉霉素的定性、定量離子

　　3.3樣品基質效應的消除

　　電噴霧離子化（ESI）方法容易受樣品基質的影響。實驗發現，樣品基質對離子化有非常強的抑制作用。為消除樣品基質效應，以待測樣品制備對應的空白樣品提取液，并以其作為標準溶液的稀釋溶液，可使標準和樣品溶液具有同樣的離子化條件。

　　3.4方法學考察

　　3.4.1方法的線性范圍與檢出限、定量限在上述條件下，以基質添加標準曲線內標法定量（標準品色譜圖如圖4所示），泰拉霉素質量濃度為10~500 g/L時，線性關系良好，線性方程為Y=90.835X 0.187,（r=0.9993）。泰拉霉素的檢出限為5 g/kg（S/N>3），定量限為10 g/kg（S/N>10），超過了國內相關標準對大環內酯類藥物檢測的靈敏度要求。

　　圖4羅紅霉素（A）內標物和泰拉霉素（B,C）的色譜圖

　　Fig.4Chromatogramsofroxithromycin（A）asinternalstandardandtulathromycin（B,C）3.4.2方法的回收率與精密度取適量空白豬肉，進行3個濃度水平（10,20和50 g/kg）的添加回收實驗，每個水平取5個平行樣（添加和空白色譜圖見圖5），結果見表2所示。方法的回收率為93.1%~105.5%;批內相對標準偏差為1.5%~4.6%;批間相對標準偏差為1.8%~5.6%;滿足了藥物殘留分析的要求。表2方法回收率及精密度。