農(nóng)業(yè)部文件
農(nóng)市發(fā)[2001]2號
關(guān)于發(fā)布飼料中鹽酸克侖特羅的測定等5項行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的通知
各省、自治區(qū)、直轄市及計劃單列市農(nóng)業(yè)、農(nóng)墾、畜牧、飼料工業(yè)主管廳（局、委、辦），農(nóng)業(yè)系統(tǒng)各有關(guān)國家級、部級質(zhì)檢中心及標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)歸口單位，部直屬各有關(guān)單位及標(biāo)準(zhǔn)起草單位：
《飼料中鹽酸克侖特羅的測定》等5項標(biāo)準(zhǔn)業(yè)經(jīng)我部審查批準(zhǔn)為中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)予發(fā)布。各項標(biāo)準(zhǔn)的編號、名稱如下：
一、強制性標(biāo)準(zhǔn)：
NY 438－2001 飼料中鹽酸克侖特羅的測定
二、推薦性標(biāo)準(zhǔn)：
（一）NY/T439-2001 蘋果外觀等級標(biāo)準(zhǔn)
（二）NY/T440-2001 梨外觀等級標(biāo)準(zhǔn)
（三）NY/T441-2001 蘋果生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程
（四）NY/T442-2001 梨生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程
以上各項行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)自2001年5月1日起實施。
二OO一年二月十五日
中華人民共和國農(nóng)業(yè)部
中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
飼料中鹽酸克侖特羅的測定
NY/TXXXX-XXXX
Determination of clenbuterol hydrochloride in feed
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以高效液相色譜 (HPLC儀和氣相色譜－質(zhì)譜 (GC-MS)儀測定飼料中鹽酸克侖特羅的方法。
規(guī)定了GC-MS法為確證法（仲裁法）。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中鹽酸克侖特羅的測定與確證。HPLC法的最低檢測限為0.5ng，(取樣5g時，最低檢測濃度為每千克試樣0.05mg)。GC-MS法最低檢測限為0.025ng，(取樣5g時，最低檢測濃度為每千克試樣0.01mg)。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
下列標(biāo)準(zhǔn)中所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。
GB/T 14699.1-1993 飼料采樣方法
GB/T 6682-1992 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3 HPLC法
3.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液將飼料中的克侖特羅鹽酸鹽溶出，溶液堿化，經(jīng)液液萃取和固相萃取柱凈化后，在HPLC儀器上分離、測定。
3.2 試劑和材料
以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682中規(guī)定的三級水。
3.2.1 甲醇: 色譜純，過0.45µm濾膜。
3.2.2 乙腈: 色譜純，過0.45µm濾膜。
3.2.3 提取液：0.5%偏磷酸溶液 (14.29g偏磷酸溶解于水，并稀釋至1L) : 甲醇=80 : 20。
3.2.4 氫氧化鈉溶液 c(NaOH)約2mol/L: 20g氫氧化鈉溶于250mL水中。
3.2.5 液液萃取用試劑
3.2.5.1 乙醚。
3.2.5.2 無水硫酸鈉。
3.2.6 氮氣。
[1]3.2.7 鹽酸溶液c(HCL)約0.02mol/L: 1.67mL鹽酸用水定容至1L。
3.2.8 固相萃取 (SPE)用試劑
3.2.8.1 30mg/lmL Oasis® HLB固相萃取小柱1) 或同等效果凈化柱。
3.2.8.2 SPE淋洗液：淋洗液-1：含2%氨水的5%甲醇水溶液； 淋洗液-2：含2%氨水的30%甲醇水溶液。
3.2.9 HPLC專用試劑
3.2.9.1 HPLC流動相：1mL1:1磷酸(優(yōu)級純)用實驗室二級水稀釋至1L，并按100:12的比例和乙腈（3.2.2）混合，用前超聲脫氣5min。
3.2.9.2 鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.2.9.2.1 貯備液，200mg/mL：10.00mg鹽酸克侖特羅(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)
溶于0.02mol/L鹽酸溶液并定容至50mL, 儲于冰箱中。有效期一個月。
3.2.9.2.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取貯備液500mL以0.02mol/L鹽酸溶液稀至50mL，儲于冰箱中。
3.2.9.2.3 標(biāo)準(zhǔn)系列：用微量移液器移取工作液(3.2.9.2.2)25、50、100、500、1000mL，以0.02mol/mL鹽酸溶液稀釋至2mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列中鹽酸克侖特羅的相應(yīng)濃度分別為：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL, 儲于冰箱中。
3.3 儀器、設(shè)備
實驗室常用儀器設(shè)備。
3.3.1 分析天平：感量0.0001g；感量0.00001g。
3.3.2 超聲水浴。
3.3.3 離心機(jī)：能達(dá)4000r/min。
3.3.4 分液漏斗：150mL。
3.3.5 電熱塊或沙浴：可控制溫度至（50～70）±5℃。
3.3.6 烘箱：溫度可控制在70+±5℃。
3.3.7 高效液相色譜儀：具有C18柱４mm (如150mm×3.9mm ID)或類似的分析柱和UV檢測器或二極管陣列檢測器。
3.4 樣品的制備
取具代表性的飼料樣品，用四分法縮減分取200g左右，粉碎過0.45mm孔徑的篩，充分混勻，裝入磨口瓶中備用。
3.5 分析步驟
3.5. 1 提取：稱取適量試樣（配合飼料5g，預(yù)混料和濃縮料2g）精確至0.0001g，置于100mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入提取液 (3.2.3) 50mL，振搖使全部潤濕，放在超聲水浴中超聲提取15min，每5min取出用手振搖一次。超聲結(jié)束后，手搖至少10s，并取上層液于離心機(jī)上4000r/min下離心10min。
3.5.2 凈化：準(zhǔn)確吸取上清液10.00mL，置150mL分液漏斗中滴加氫氧化鈉溶液(3.2.4)，充分振搖，調(diào)pH至11～12，該過程反應(yīng)較慢，放置3~5min后，檢查pH，如pH降低。需再加堿調(diào)節(jié)。溶液用30、25mL乙醚萃取兩次，令醚層通過無水硫酸鈉干燥，用少許乙醚淋洗分液漏斗和無水硫酸鈉，并用乙醚定容至50mL。準(zhǔn)確吸取25.00mL于50mL燒杯中，置通風(fēng)櫥內(nèi)，低于50℃加熱塊或沙浴(3.3.6)上蒸干，殘渣溶于2.00mL鹽酸溶液 (3.2.7)，取1.00mL置于預(yù)先已分別用1mL甲醇和1mL去離子水處理過的SPE小柱上，用注射器稍稍加壓，使其過柱速度不超過1mL/min，再先后分別用1mlSPE淋洗液-1和-2淋洗(3.2.8.2)，最后用甲醇洗脫，洗脫液置70±5℃加熱塊或沙浴上、用氮氣吹干。
3.5.3 測定
3.5.3.1 于凈化、吹干的樣品殘渣中準(zhǔn)確加入1.00～2.00mL鹽酸溶液（3.2.7），充分振搖，
超聲，使殘渣溶解，必要時過0.45mm的濾膜，清液上機(jī)測定，用鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)系列（3.2.9.2.3）進(jìn)行單點或多點校準(zhǔn)。
3.5.3.2 HPLC測定參數(shù)設(shè)定：
色譜柱：C18 柱，150mm×3.9mmID，粒度 4mm 或類似的分析柱。
柱溫：室溫。
流動相：0.05%磷酸水溶液 : 乙腈=100 : 12（3.2.9.1），流速：1.0ml/min。
檢測器：二極管陣列或UV檢測器。
檢測波長：210nm或243nm。
進(jìn)樣量：20～50mL。
3.5.3.3 定性定量方法
定性方法：除了用保留時間定性外，還可用二極管陣列測定鹽酸克侖特羅紫外光區(qū)的特征光譜，即在210、243和296nm有三個峰值依次變低的吸收峰。
定量方法：積分得到峰面積，而后用單點或多點校準(zhǔn)法定量。
3.6 分析結(jié)果的表述
每千克試樣中所含鹽酸克侖特羅的質(zhì)量按式（1）計算
X=
m1
×D
m
----------- (1)
式中：X—每千克試樣中鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
m1－HPLC色譜峰的面積對應(yīng)的鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
D—稀釋倍數(shù)；
m—所稱量的樣品質(zhì)量，g。
結(jié)果表示至小數(shù)點后1位。
3.7 允許差
取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩個平行測定的相對偏差不大于10%。
4. <![endif]>GC-MS 法（確證法，仲裁法）
4.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液將飼料中的克侖特羅鹽酸鹽溶出，溶液堿化，經(jīng)液液萃取和固相萃取柱凈化后，在GC-MS聯(lián)用儀上分離、測定。
4.2 試劑和材料
以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682中規(guī)定的三級水。
4.2.1 提取凈化用試劑：同HPLC法中 3.2.1~3.2.8。
4.2.2 衍生劑：N，O—雙三甲基甲硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。
4.2.3 甲苯。
4.2.4 鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液
4.2.4..1 貯備液，200mg/mL：10.00mg鹽酸克侖特羅(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)溶于甲醇并定容至50mL,儲于冰箱中。有效期三個月。
4.2.4.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取貯備液(4.2.3.1)500mL以甲醇稀釋至50mL, 儲于冰箱中。
4.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)系列：用微量移液器移取工作液(4.2.3.2)25、50、100、500、1000mL，以甲醇稀釋至2mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列中鹽酸克侖特羅的相應(yīng)濃度為：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL,儲于冰箱中。
4.3 儀器、設(shè)備
4.3.1 樣品前處理設(shè)備同HPLC法3.3.1~3.3.7。
4.3.2 GC-MS聯(lián)用儀：裝有弱極性或非極性的毛細(xì)管柱的氣相色譜儀和具電子轟擊離子源及檢測器。
4. 4 樣品的制備
同HPLC法(3.4)。
4.5 分析步驟
4.5.1 提取 同HPLC法3.5.1。
4.5.2 凈化 同HPLC法3.5.2。
4.5.3 測定
4.5.3.1 衍生：于凈化、吹干的樣品殘渣中加入衍生劑BSTFA(4.2.2) 50mL，充分渦旋混合后，置70℃±5℃烘箱中，衍生反應(yīng)30min。用氮氣吹干，加甲苯（4.2.3）100mL，混勻，上GC-MS聯(lián)用儀測定。同時用鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)系列(4.2.4.3)做同步衍生。
4.5.3.2 GC-MS測定參數(shù)設(shè)定：
色譜柱：DB-5MS, 30m×0.25mm ID 0.25µm。
載氣：氦氣， 柱頭壓：50 KPa。
進(jìn)樣口溫度：260℃。
進(jìn)樣量：1mL，不分流。
柱溫程序：70℃保持1min，以25℃/min速度升至200℃，于200℃保持6min，再以25℃/min的速度升至280℃并保持2min。
EI源電子轟擊能：70eV。
檢測器溫度：200℃。
接口溫度：250℃。
質(zhì)量掃描范圍（AMU）：60～400。
溶劑延遲：7min。
檢測用克侖特羅三甲基硅烷衍生物的特征質(zhì)譜峰：
M/Z=86、187、243、262。
4.5.3.3 定性定量方法
定性方法：樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的相對偏差不大于0.5%。特征離子基峰百分?jǐn)?shù)與標(biāo)準(zhǔn)品相差不大于20%。
定量方法：選擇離子監(jiān)測 (SIM) 法計算峰面積，單點或多點校準(zhǔn)法定量。
4.6 分析結(jié)果的表述
每千克試樣中所含鹽酸克侖特羅的質(zhì)量按式（2）計算
X=
m2
×D
m
---------- (2)
式中：X—每千克試樣中鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
m2－GC-MS色譜峰的面積對應(yīng)的鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
D—稀釋倍數(shù)；
m—所稱量的樣品質(zhì)量，g。
結(jié)果表示至小數(shù)點后1位。
4.7 允許差
取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩個平行測定的相對偏差不大于20%。
1 ) Oasis® HLB固相萃取小柱是由 Waters Corperation (34 Maple Street Milford MA,USA)提供的產(chǎn)品的商品名稱,給出這一信息是為了給本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的使用者提供方便,而不是標(biāo)準(zhǔn)主管部門對這一產(chǎn)品的認(rèn)可。
農(nóng)市發(fā)[2001]2號
關(guān)于發(fā)布飼料中鹽酸克侖特羅的測定等5項行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的通知
各省、自治區(qū)、直轄市及計劃單列市農(nóng)業(yè)、農(nóng)墾、畜牧、飼料工業(yè)主管廳（局、委、辦），農(nóng)業(yè)系統(tǒng)各有關(guān)國家級、部級質(zhì)檢中心及標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)歸口單位，部直屬各有關(guān)單位及標(biāo)準(zhǔn)起草單位：
《飼料中鹽酸克侖特羅的測定》等5項標(biāo)準(zhǔn)業(yè)經(jīng)我部審查批準(zhǔn)為中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)予發(fā)布。各項標(biāo)準(zhǔn)的編號、名稱如下：
一、強制性標(biāo)準(zhǔn)：
NY 438－2001 飼料中鹽酸克侖特羅的測定
二、推薦性標(biāo)準(zhǔn)：
（一）NY/T439-2001 蘋果外觀等級標(biāo)準(zhǔn)
（二）NY/T440-2001 梨外觀等級標(biāo)準(zhǔn)
（三）NY/T441-2001 蘋果生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程
（四）NY/T442-2001 梨生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程
以上各項行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)自2001年5月1日起實施。
二OO一年二月十五日
中華人民共和國農(nóng)業(yè)部
中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)
飼料中鹽酸克侖特羅的測定
NY/TXXXX-XXXX
Determination of clenbuterol hydrochloride in feed
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以高效液相色譜 (HPLC儀和氣相色譜－質(zhì)譜 (GC-MS)儀測定飼料中鹽酸克侖特羅的方法。
規(guī)定了GC-MS法為確證法（仲裁法）。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料中鹽酸克侖特羅的測定與確證。HPLC法的最低檢測限為0.5ng，(取樣5g時，最低檢測濃度為每千克試樣0.05mg)。GC-MS法最低檢測限為0.025ng，(取樣5g時，最低檢測濃度為每千克試樣0.01mg)。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
下列標(biāo)準(zhǔn)中所包含的條文，通過在本標(biāo)準(zhǔn)中引用而構(gòu)成為本標(biāo)準(zhǔn)的條文。本標(biāo)準(zhǔn)出版時，所示版本均為有效。所有標(biāo)準(zhǔn)都會被修訂，使用本標(biāo)準(zhǔn)的各方應(yīng)探討使用下列標(biāo)準(zhǔn)最新版本的可能性。
GB/T 14699.1-1993 飼料采樣方法
GB/T 6682-1992 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3 HPLC法
3.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液將飼料中的克侖特羅鹽酸鹽溶出，溶液堿化，經(jīng)液液萃取和固相萃取柱凈化后，在HPLC儀器上分離、測定。
3.2 試劑和材料
以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682中規(guī)定的三級水。
3.2.1 甲醇: 色譜純，過0.45µm濾膜。
3.2.2 乙腈: 色譜純，過0.45µm濾膜。
3.2.3 提取液：0.5%偏磷酸溶液 (14.29g偏磷酸溶解于水，并稀釋至1L) : 甲醇=80 : 20。
3.2.4 氫氧化鈉溶液 c(NaOH)約2mol/L: 20g氫氧化鈉溶于250mL水中。
3.2.5 液液萃取用試劑
3.2.5.1 乙醚。
3.2.5.2 無水硫酸鈉。
3.2.6 氮氣。
[1]3.2.7 鹽酸溶液c(HCL)約0.02mol/L: 1.67mL鹽酸用水定容至1L。
3.2.8 固相萃取 (SPE)用試劑
3.2.8.1 30mg/lmL Oasis® HLB固相萃取小柱1) 或同等效果凈化柱。
3.2.8.2 SPE淋洗液：淋洗液-1：含2%氨水的5%甲醇水溶液； 淋洗液-2：含2%氨水的30%甲醇水溶液。
3.2.9 HPLC專用試劑
3.2.9.1 HPLC流動相：1mL1:1磷酸(優(yōu)級純)用實驗室二級水稀釋至1L，并按100:12的比例和乙腈（3.2.2）混合，用前超聲脫氣5min。
3.2.9.2 鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液
3.2.9.2.1 貯備液，200mg/mL：10.00mg鹽酸克侖特羅(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)
溶于0.02mol/L鹽酸溶液并定容至50mL, 儲于冰箱中。有效期一個月。
3.2.9.2.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取貯備液500mL以0.02mol/L鹽酸溶液稀至50mL，儲于冰箱中。
3.2.9.2.3 標(biāo)準(zhǔn)系列：用微量移液器移取工作液(3.2.9.2.2)25、50、100、500、1000mL，以0.02mol/mL鹽酸溶液稀釋至2mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列中鹽酸克侖特羅的相應(yīng)濃度分別為：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL, 儲于冰箱中。
3.3 儀器、設(shè)備
實驗室常用儀器設(shè)備。
3.3.1 分析天平：感量0.0001g；感量0.00001g。
3.3.2 超聲水浴。
3.3.3 離心機(jī)：能達(dá)4000r/min。
3.3.4 分液漏斗：150mL。
3.3.5 電熱塊或沙浴：可控制溫度至（50～70）±5℃。
3.3.6 烘箱：溫度可控制在70+±5℃。
3.3.7 高效液相色譜儀：具有C18柱４mm (如150mm×3.9mm ID)或類似的分析柱和UV檢測器或二極管陣列檢測器。
3.4 樣品的制備
取具代表性的飼料樣品，用四分法縮減分取200g左右，粉碎過0.45mm孔徑的篩，充分混勻，裝入磨口瓶中備用。
3.5 分析步驟
3.5. 1 提取：稱取適量試樣（配合飼料5g，預(yù)混料和濃縮料2g）精確至0.0001g，置于100mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入提取液 (3.2.3) 50mL，振搖使全部潤濕，放在超聲水浴中超聲提取15min，每5min取出用手振搖一次。超聲結(jié)束后，手搖至少10s，并取上層液于離心機(jī)上4000r/min下離心10min。
3.5.2 凈化：準(zhǔn)確吸取上清液10.00mL，置150mL分液漏斗中滴加氫氧化鈉溶液(3.2.4)，充分振搖，調(diào)pH至11～12，該過程反應(yīng)較慢，放置3~5min后，檢查pH，如pH降低。需再加堿調(diào)節(jié)。溶液用30、25mL乙醚萃取兩次，令醚層通過無水硫酸鈉干燥，用少許乙醚淋洗分液漏斗和無水硫酸鈉，并用乙醚定容至50mL。準(zhǔn)確吸取25.00mL于50mL燒杯中，置通風(fēng)櫥內(nèi)，低于50℃加熱塊或沙浴(3.3.6)上蒸干，殘渣溶于2.00mL鹽酸溶液 (3.2.7)，取1.00mL置于預(yù)先已分別用1mL甲醇和1mL去離子水處理過的SPE小柱上，用注射器稍稍加壓，使其過柱速度不超過1mL/min，再先后分別用1mlSPE淋洗液-1和-2淋洗(3.2.8.2)，最后用甲醇洗脫，洗脫液置70±5℃加熱塊或沙浴上、用氮氣吹干。
3.5.3 測定
3.5.3.1 于凈化、吹干的樣品殘渣中準(zhǔn)確加入1.00～2.00mL鹽酸溶液（3.2.7），充分振搖，
超聲，使殘渣溶解，必要時過0.45mm的濾膜，清液上機(jī)測定，用鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)系列（3.2.9.2.3）進(jìn)行單點或多點校準(zhǔn)。
3.5.3.2 HPLC測定參數(shù)設(shè)定：
色譜柱：C18 柱，150mm×3.9mmID，粒度 4mm 或類似的分析柱。
柱溫：室溫。
流動相：0.05%磷酸水溶液 : 乙腈=100 : 12（3.2.9.1），流速：1.0ml/min。
檢測器：二極管陣列或UV檢測器。
檢測波長：210nm或243nm。
進(jìn)樣量：20～50mL。
3.5.3.3 定性定量方法
定性方法：除了用保留時間定性外，還可用二極管陣列測定鹽酸克侖特羅紫外光區(qū)的特征光譜，即在210、243和296nm有三個峰值依次變低的吸收峰。
定量方法：積分得到峰面積，而后用單點或多點校準(zhǔn)法定量。
3.6 分析結(jié)果的表述
每千克試樣中所含鹽酸克侖特羅的質(zhì)量按式（1）計算
X=
m1
×D
m
----------- (1)
式中：X—每千克試樣中鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
m1－HPLC色譜峰的面積對應(yīng)的鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
D—稀釋倍數(shù)；
m—所稱量的樣品質(zhì)量，g。
結(jié)果表示至小數(shù)點后1位。
3.7 允許差
取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩個平行測定的相對偏差不大于10%。
4. <![endif]>GC-MS 法（確證法，仲裁法）
4.1 方法提要
用加有甲醇的稀酸溶液將飼料中的克侖特羅鹽酸鹽溶出，溶液堿化，經(jīng)液液萃取和固相萃取柱凈化后，在GC-MS聯(lián)用儀上分離、測定。
4.2 試劑和材料
以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為符合GB/T 6682中規(guī)定的三級水。
4.2.1 提取凈化用試劑：同HPLC法中 3.2.1~3.2.8。
4.2.2 衍生劑：N，O—雙三甲基甲硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)。
4.2.3 甲苯。
4.2.4 鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液
4.2.4..1 貯備液，200mg/mL：10.00mg鹽酸克侖特羅(含C12H18Cl2N2O· HCl不少于98.5%)溶于甲醇并定容至50mL,儲于冰箱中。有效期三個月。
4.2.4.2 工作液，2.00mg/mL：用微量移液器移取貯備液(4.2.3.1)500mL以甲醇稀釋至50mL, 儲于冰箱中。
4.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)系列：用微量移液器移取工作液(4.2.3.2)25、50、100、500、1000mL，以甲醇稀釋至2mL，該標(biāo)準(zhǔn)系列中鹽酸克侖特羅的相應(yīng)濃度為：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00mg/mL,儲于冰箱中。
4.3 儀器、設(shè)備
4.3.1 樣品前處理設(shè)備同HPLC法3.3.1~3.3.7。
4.3.2 GC-MS聯(lián)用儀：裝有弱極性或非極性的毛細(xì)管柱的氣相色譜儀和具電子轟擊離子源及檢測器。
4. 4 樣品的制備
同HPLC法(3.4)。
4.5 分析步驟
4.5.1 提取 同HPLC法3.5.1。
4.5.2 凈化 同HPLC法3.5.2。
4.5.3 測定
4.5.3.1 衍生：于凈化、吹干的樣品殘渣中加入衍生劑BSTFA(4.2.2) 50mL，充分渦旋混合后，置70℃±5℃烘箱中，衍生反應(yīng)30min。用氮氣吹干，加甲苯（4.2.3）100mL，混勻，上GC-MS聯(lián)用儀測定。同時用鹽酸克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)系列(4.2.4.3)做同步衍生。
4.5.3.2 GC-MS測定參數(shù)設(shè)定：
色譜柱：DB-5MS, 30m×0.25mm ID 0.25µm。
載氣：氦氣， 柱頭壓：50 KPa。
進(jìn)樣口溫度：260℃。
進(jìn)樣量：1mL，不分流。
柱溫程序：70℃保持1min，以25℃/min速度升至200℃，于200℃保持6min，再以25℃/min的速度升至280℃并保持2min。
EI源電子轟擊能：70eV。
檢測器溫度：200℃。
接口溫度：250℃。
質(zhì)量掃描范圍（AMU）：60～400。
溶劑延遲：7min。
檢測用克侖特羅三甲基硅烷衍生物的特征質(zhì)譜峰：
M/Z=86、187、243、262。
4.5.3.3 定性定量方法
定性方法：樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時間的相對偏差不大于0.5%。特征離子基峰百分?jǐn)?shù)與標(biāo)準(zhǔn)品相差不大于20%。
定量方法：選擇離子監(jiān)測 (SIM) 法計算峰面積，單點或多點校準(zhǔn)法定量。
4.6 分析結(jié)果的表述
每千克試樣中所含鹽酸克侖特羅的質(zhì)量按式（2）計算
X=
m2
×D
m
---------- (2)
式中：X—每千克試樣中鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
m2－GC-MS色譜峰的面積對應(yīng)的鹽酸克侖特羅的質(zhì)量，mg；
D—稀釋倍數(shù)；
m—所稱量的樣品質(zhì)量，g。
結(jié)果表示至小數(shù)點后1位。
4.7 允許差
取平行測定結(jié)果的算術(shù)平均值為測定結(jié)果，兩個平行測定的相對偏差不大于20%。
1 ) Oasis® HLB固相萃取小柱是由 Waters Corperation (34 Maple Street Milford MA,USA)提供的產(chǎn)品的商品名稱,給出這一信息是為了給本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的使用者提供方便,而不是標(biāo)準(zhǔn)主管部門對這一產(chǎn)品的認(rèn)可。
