隨著抗生素在乳畜飼養業中的廣泛應用，牛奶中抗生素殘留問題日趨受到國際社會的重視。對此，檢測技術也迅速發展，以尋求簡便、快速、準確、敏感性高的檢測方法滿足日趨嚴格的殘留限量的要求，保障人們飲用牛奶的衛生和安全。

　　1牛奶中抗生素殘留的來源及其危害

　　一般認為，對泌乳牛用藥不當或不注意安全時間是牛乳中抗生素殘留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治療乳腺炎時，易造成牛乳中抗生素殘留。隨著畜牧業的發展，在牛飼料中添加飼料添加劑已十分廣泛，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是預防疾病的發生，這也是牛乳抗生素殘留重要原因。此外，在高溫季節，一些不法交奶戶為防止乳的酸敗，往往向牛乳中摻雜各種抗生素，這也是乳中抗生素殘留的一個來源。1983年，egan調查表明，重用經抗生素治療的乳牛用過的擠乳器給正常乳中擠乳，可使正常牛的乳中殘留抗生素，于是他指出：擠乳是乳中抗生素淺留的另一個來源。

　　牛奶是老少皆宜的營養品，牛奶中若含有抗生素，對長期飲用者來說無疑是等于長期服用小劑量的抗生素，對抗生素有過敏體質的人服用殘留抗生素的乳后會發生過敏反應。即使是正常飲用者，體內的某些條件性致病菌易產生耐藥性，一旦患者再用同種抗生素治療很難奏效。抗生素是奶牛場治療乳房炎的常規藥物。由于長期大量使用抗生素，使耐藥菌株增加，一些乳房炎病例變得難以用常規方法治愈。這又促使臨診獸醫在治療過程中加大抗生素的用量。此外，牛奶中抗生素殘留會影響奶制品的品質，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，則殘留在其中的抗生素會抑制細菌的發酵，使產量和質量降低。因此市場不允許出售抗生素殘留過量的牛奶，這樣也造成牛奶生產者的經濟損失。

　　2牛奶中的抗生素殘留檢測方法研究進展

　　微生物檢測法是應用較廣泛的方法，如紙片法、ttc法等等，因其測定原理基于抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用，因而與臨床應用的要求一致，但其測定時間長且結果誤差較大。目前趨向靈敏、準確、簡便、快速的微生物檢測方法研究，如酶標抗體檢測法等。

　　紙片法，即pd法（paper disc）。將一吸滿受檢乳樣的濾紙圓片放入一接種枯草桿菌的瓊脂平皿上，并放入一含有標準抗生素的陽性對照圓片。將陪替氏培養皿在32℃下培養17－ 24h，然后觀察有無抑菌圈，若要判定結果是否為真陽性，則需將乳樣在82℃下加熱2－3min，冷卻，再重復試驗。該方法對奶樣中青霉素殘留的檢測限可達0．0lIu／ml。崗田雪南（1986）應用pd法調查日本島根縣540份生乳，陽性55份（l0．2％）；并指出乳中的一些抗菌物質如溶菌酶、乳膽鐵質等等影響試驗結果。而嗜熱脂肪桿菌紙片檢測法僅用于檢測奶樣中β-內酰胺類抗生素，并能暗示是否還存在其它抑菌物質，檢測限可達0．008iu／ml以下。一般在4h內即可獲得有關乳中是否還存在β-內酰胺抗生素殘留的結果。

　　ttc，即氯化三苯基四氮唑（ tripheye tetrazolium chloride），這是目前我國食品衛生標準中規定的檢查牛乳中抗生素殘留的檢測方法（gb5409—85）。如果牛乳中有抗生素存在，當乳中加入菌種（嗜熱鏈球菌）經培養后，菌種不增殖，此時加入的ttc指示劑不發生還原反應，所以仍呈無色狀態；如果沒有抗生素存在，則加入菌種即行增殖，ttc還原變成紅色，使樣品染成紅色。周樹南采用ttc法調查了江蘇省8市10個牧場生奶、消毒牛奶和奶粉中抗生素殘留情況，生奶陽性率3.6％，消毒牛奶11．4％，奶粉39．58％。1991年，李權超用ttc法檢測長春市鮮牛奶中抗生素殘留情況，結果陽性率3.3％，可疑率18.3％。

　　此外，王春奕等用圓盤法對西寧市消毒鮮牛奶中抗生素殘留調查。實驗結果表明檢測的5批25份市售消毒鮮牛奶中抗生素殘留質量分數在1.5×10以上，超過了世界衛生組織（who）和聯合國糧農組織（fao）規定的奶中青霉素含量為0的標準。并認為這可能與飼料中添加的抗生素過量和獸醫臨床上大劑量、長期使用抗生素有關。

　　理化檢測方法是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，如高效液相色譜法、氣相色譜法、比色法、熒光分光光度法等等，能進行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但有的檢測程序較復雜，有的檢測費用較高。

　　高效液相色譜是目前廣泛應用的一種理化檢測方法，它引入了氣相色譜理論，在技術上采用了高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分離速度快、效率高和操作自動化。高效液相色譜法測定牛奶中的藥物殘留都要經歷樣品處理（包括樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟）、殘留藥物的分離和殘留藥物的檢測。

　　樣品的提取一般使用水和酸化有機溶劑，兩者可以同時達到脫蛋白和萃取殘留的目的。加拿大hal使用鎢酸鈉、硫酸和水從組織中提取青霉素并脫掉蛋白質。這種方法對牛奶中的青霉素效果非常好。樣品經提取后要進行蛋白質沉淀。脫蛋白的常用有機溶劑有甲醇、乙腈和2一丙醇；無機酸有硫酸和鎢酸鈉、酸化乙腈（ph4.0－4.4），以及超濾法等。bioson等通過把青霉素萃取入水相中，在硫酸和鎢酸鈉的存在下，已能減少幾種非極性化合物的污染，得到比較干凈的水提取液。為了從生物體液和動物組織中提取青霉素殘留，barker等提出了基體固相分散技術（mspd），即把樣品基體與固相填料（如c填料）混合攪拌均勻，然后把攪拌均勻的物質填充到層析柱中，用適當的溶劑淋洗上層分析物。

　　通常，得到的水提取液或有機提取液中，目標分析物濃度都很低，還含有許多共萃物，如果這些物質在最終的溶液中存在，不僅會損害色譜儀器，也會增加檢測的噪音，無法測定痕量濃度的目標分析物。為了降低背景化合物的干擾，通常需要對目標分析物進行凈化與濃縮。常用的凈化和濃縮方法有離子交換（ie）、固相萃取（spe）和免疫親合色譜法（iac）。moats等在分析青霉素殘留時，首次嘗試把自動在線痕量富集的方法用于樣品凈化。這種半自動化技術使用餾分收集器收集色譜淋洗液中預先確定的餾分。把收集到的餾分濃縮后，再進行液相色譜測定。此法已用于測定牛奶中的羥氨芐青霉素，鄰氯青霉素和苯氧甲基青霉素。氨芐青霉素和羥氨芐青霉素。

　　殘留組分的分離方式包括正相、反相和離子交換等幾種分離手段。近幾年來大都改用反相色譜法，最常用的分析柱填料為ods－c。反相hplc具有高效、短時，并在含水系統中完成分析等特點。某些含有立體異構體的藥物，如氨芐青霉素、苯氧乙基青霉素以及羧芐青霉素等，也可用離子對反相（rp）hplc來改善其分離效果。但對強極性的青霉素類藥物，如頭孢三嗪，分離效果不甚理想。在流動相中加入離子對試劑，以改善其分離的選擇性。

　　青霉素藥物被分離后，最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。彭莉等報道了用高效液相色譜法（hplc）檢測牛奶中氯霉素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯霉素，用正烷一氯仿（1+1，v／v）溶解殘渣，以乙腈一0.005mol／l磷酸氫二銨（l＋ 82， v／v）作為流動相，用高效液相色譜儀紫外檢測器在278nm檢測。平均加收率94.8%，變異系數＜12.0%。樣品前處理簡單、回收率高、實用性強、檢疫靈敏度高、重視性好、檢測數據準確可靠，可作為牛奶中氯霉素殘留檢測的確證方法。由于奶樣中藥物殘留量少，背景干擾往往很嚴重，因此一般都使用柱前或柱后衍生技術，通過柱前衍生反應可以有效地提高紫外檢測器檢測殘留的靈敏度。目前，隨著接口技術的顯著改進，質譜作為一種質量流速型檢測器，正廣泛應用于殘留分析的檢測中。電化學檢測器也已用于檢測鄰氯青霉素、頭孢菌素和青霉素。

　　由于其固有的高靈敏度，熒光檢測法在多數lc分析中要優于紫外檢測法。terada利用氨芐青霉素在甲醛和三氯乙酸溶液中形成能產生熒光的衍生產物的原理，用熒光檢測器，測定牛奶中氨芐青霉素殘留量。這不僅提高了方法的選擇性，而且靈敏度可達1μg／l。此外還有用dansylaziridine、9一芴基甲基氯甲酸酯和4一溴甲基一7甲氧香豆素為衍生化試劑的報道，但由于受到多種因素的限制，應用并不多。盡管測定原理不同，但樣品的前處理步驟并沒有多大區別，都要經歷樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱凈化、衍生化等步驟，而所選用色譜柱均為反相柱，流動相為有機溶劑和磷酸鹽緩沖液。總之，液相色譜法測定牛奶中藥物殘留的方法正逐漸成熟起來。

　　色／質聯用法由于實現了高效層析分離和檢測聯機，可用微電腦控制層析條件、程序和數據處理，其特異性、靈敏度和重復性均好，并可一次同時完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測。對分析牛奶中青霉素類抗生素，質譜作為一種專一檢測器已獲得廣泛應用。其分析方式有直接探頭分析法、直接液體導入法、gc／ms、lc／ms聯用法等。使用電子轟擊離子化、化學電離、快速原子轟擊、熱噴霧電離、等離子體噴霧、粒子束電離、大氣壓化學電離（apci）和電噴霧電離（esi）技術對不同ms離子源條件下青霉素類藥物分子碎片類型的特征已經作了大量的工作。另外離子阱質譜技術（ms／ms）也已用于鑒別青霉素類藥物。

　　1991年，tyczkowska等曾用熱噴質譜技術鑒別了牛奶中的青霉素g。該方法使用苯氧甲基青霉素作內標，牛奶樣品用鎢酸鈉沉淀蛋白后，上清液用bond elut cspe固相柱凈化，用乙腈一0.0125mol／l醋酸胺（60＋40）洗脫青霉素。洗脫液直接用 tsp／ms測定。測定低限為0．005mg／kg。bioson使用tsp／lc／ms對牛奶和動物組織中殘留的青霉素進行測定和確證。后來又使用連接紫外檢測器的lc／tsp／ms確證了牛奶中的青霉素g。

　　隨著電噴霧接口技術的成熟，lc／esi／ms技術已廣泛用于測定牛奶中的青霉素類抗生素。由于采用選擇離子檢測方式，故不僅提高了該測定方法的靈敏度，同時也使得方法的選擇性得到很大改善。straub等使用lc／es／ms測定了牛奶中的幾種青霉素殘留。青霉素、鄰氯青霉素與芐青霉素的最低測定限為3－5μg／kg，氨芐青霉素與羥氨青霉素的最低測定限為20－30μg／ml。

　　隨著離子阱技術中色／質聯用法中的應用，heller等使用電噴霧離子化串聯離子阱質譜技術測定了牛奶中7種青霉素類抗生素殘留。該法可檢測牛奶中低至5μg／l（芐青霉素）與10μg／l（頭孢噻呋、頭孢匹林、頭孢哇啉、氨芐青霉素、羥氯青霉素和鄰氯青霉素）水平的7種青霉素類抗生素殘留。這種檢測技術盡管靈敏度很高，得到的結構信息也比較多。由于影響因素比較復雜，結果的重現性并不理想，再加上離子阱的空間較少，更易受到樣品基體的干擾，所以這種技術用于牛奶中抗生素殘留的檢測還需做深入的研究工作。此外，張素霞等報道了用mspd－hplc－uv分析法檢測牛奶中四環素類藥物殘留。樣品平均回收率為78．7％－90．2％，變異系數在2．4％－18．8％之間，方法檢測限為0．02－0.05μg／ml。kihak等以

　　ncl方式的 lc／pb／ms技術成功對牛奶中otc、tc與ctc殘留進行確證。fenneell等使用反相hplc／pda測定了牛奶中及肉制品中的慶大霉素組分，檢測限為0.5μg／ml。

　　宋華賓等依據抗生素的一些特殊呈色反應檢測牛乳中的氯霉素、四環素、土霉素、鏈霉素、紅霉素和慶大霉素，方法簡便、快速，并且能半定量。另外，利用抗生素對牛乳變酸的抑制作用進行抗生素殘留檢測，當酸牛乳培養物加入后，用溴甲酚紫指示劑檢測其酸性變化，并據此作出判斷，此法檢出量：青霉素0.0000liu／ml，鏈霉素 5mg／kg。

　　目前藥物殘留免疫分析技術主要分為兩大類：一為相對獨立的分析方法，即免疫測定法（immunoassays，ias），如

　　ria、elisa、固相免疫傳感器（soindphas immunosensor）等；二是將免疫分析技術與常規理化分析技術聯用，如利用免疫分析的高選擇性作為理化測定技術中的凈化手段，典型的方式為免疫親合色譜（immunoaffinity

　　chromatopphy，iac）。

　　抗生素殘留監測中的免疫測定法只能作為篩選方法，其定量效果還有待進一步研究。如watanabe等制備了卡那霉素結合抗原，并篩選單克隆抗體，用直接競爭elisa法測定牛奶樣品，檢測限為4ng／ml。此外，還設計了測定試紙：載體為硝酸纖維薄膜，標記物為卡那霉素一hrp，底物為5一溴一4－4氯一3吲哚磷酸二鈉，檢測限達50ng／ml。schnappinger等建立了牛奶中鏈霉素和雙氫鏈霉素的直接競爭elis，樣品經離心脫脂（4

　　000g， 20min）和 pbs稀釋后直接測定，檢測限分別為0.6ng／ml和0．4ng／ml。haasnoot等報道了牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素和新霉素直接競爭elisa測定法，檢測限達10－15ng／ml。

　　1966年，hamburser首次制備發現抗氯霉素抗體。1984年，arnold等建立了氯霉素的放射免疫測定法（ria），并與gc／ecd進行了比較，檢測限為0.6ng／kg。

　　van de water等報道了牛奶中氯霉素的免疫親合色譜（iac）凈化法，樣品經離心、過濾和稀釋（固體樣品首先用水提取）后用iac柱凈化，hplc／uvd測定，回收率70％－99％。牛奶樣品的檢測限最低可達20ng／l（由于iac的高度選擇性方法檢測限將主要決定于取樣量地通過柱切系統，haagsma等還進一步建立了牛奶中氯霉素的在線親和色譜／hplc／uvd測定法，能直接分析液體樣品或提取液。

　　huth用熒光免疫法測定牛奶中的6種β一內酰胺類抗生素，檢測分析系統組成：一個內含4個毛細管的測定管、一個帶有4個用來干燥試劑的凹面的試劑盤和一個毛細管反應器。反應在毛細管反應器內進行，并通過毛細管反應器識別熒光顯示結果，然后輸出測定結果。牛奶中β一內酰胺類抗生素的最低檢測限為：青霉素g，3.2μg／kg、氨芐青霉素，2．9μg／kg、羥氨芐青霉素，3．6μg／kg、鄰氯青霉素，7．4μg／kg、頭孢匹林，16．3μg／kg、頭孢噻呋33．7μg／kg。

　　綜上所述，鑒于牛奶中抗生素殘留是涉及人類健康的公共衛生問題，應重視和加強檢測工作，并且努力研究一些簡便、快速、敏感、準確的檢測方法，保證消費者的健康。