禽流感（Avian Influenza, AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征。A型流感病毒的核衣殼蛋白(NP)和基質蛋白(MP)具有相似的抗原性，根據血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)的抗原性不同，可進行亞型分類。現已有15個HA亞型(H1~H15)和9個N亞型(N1~N9)。

　　在有記載的禽病史上，高致病性禽流感(HPAI)是一種毀滅性的疾病，每一次嚴重的爆發都給養禽業造成巨大的經濟損失。目前在美洲、歐洲、亞洲、非洲、澳大利亞等世界上許多國家和地區都曾發生過本病。1997年，香港爆發HPAI，病原為H5N1 亞型HPAI病毒，為了控制疫情，全港共撲殺了150萬只家禽，直接耗資6000萬港幣，用于對養禽業的補貼高達10億港幣。1999年3月，意大利北部的家禽感染了H7N1亞型HPAI病毒，隨后幾個月就有13億只家禽感染。2001年，香港再次發生HAPI，又撲殺了120萬只活禽，造成了巨大的經濟損失.

　　2003年初新澤西暴發H7N7亞型的HPAI，共撲殺了3000萬只家禽。我國內地在2000年以來，也發生了H5N1亞型的HPAI，不僅雞高度易感，其他家禽也易感，給我國的禽業生產造成了巨大的經濟損失。由于HPAI是OIE規定的A類傳染病，我國的活禽及禽類產品出口受挫，貿易銳減。2001年6月4日，韓國農林部宣布從上海某公司進口的禽肉中檢測到H5N1亞型 HPAI病毒，并且即日起禁止從中國進口家禽和相關產品。2001年6月8日，日本也宣布暫停從中國進口家禽及禽產品。

　　1997年香港AI事件首次報道AIV跨越種間障礙感染人，則使AI具有重要的公共衛生意義，它打破了人們對AI公共衛生學意義的傳統認知模式。調查表明1997年香港AIV事件中，共有18人感染，6人死亡，而且接觸過感染AI病人的醫護人員有3.7%的人員能檢測到H5N1亞型AIV的抗體，而沒有接觸過感染AIV病人的醫護人員的抗體檢出率僅為0.7%，參與政府撲殺家禽的約有3%的工作人員檢出了H5N1亞型AIV的抗體，有10%以上的雞場內的工人對H5N1亞型AIV血清學檢測結果為陽性。截止至2004年2月，泰國有3名患者死于AI。2004年越南爆發AI，AI患者累計達65人，其中有10人死亡。有證據表明AI也有可能與人類歷史上的流感爆發有關。AIV感染人后，一旦發生受體結合特性的轉變，獲得了在人體內高效傳播的能力，將對人類健康造成巨大的威脅。

　　AI的潛伏期從幾個小時到幾天不等，其長短與病毒的致病性高低、感染強度、傳播途徑和感染禽種類有關。AI的臨診癥狀也因感染禽的種類、年齡、性別、并發感染情況及所感染毒株的毒力和其它環境因素等不同而表現很不一致，可涉及呼吸道、消化道、生殖道及神經系統，一般來說沒有特異性的癥狀，使臨床診斷AI有一定的難度，則需要實驗室檢測協助。

　　下面介紹幾種常用的檢測AIV的實驗室技術。

　　1.1病原學檢測--病毒的分離與鑒定

　　將病料以尿囊腔途徑接種9~11日齡的SPF雞胚，收集死亡雞胚尿囊液，將收獲的雞胚尿囊液進行血凝價檢測，當血凝滴度達1:16以上時，確定病毒分離為陽性。若初次傳代獲得的尿囊液未檢測到血凝性，需再盲傳兩代，若仍未檢測到血凝性則認為病毒分離陰性。將收獲的雞胚尿囊液進行血凝抑制試驗，若被AIV標準陽性血清抑制，而不被雞新城疫病毒、產蛋下降綜合征病毒等疾病的標準陽性血清抑制，則可初步認定分離到的病毒為AIV。

　　1.2血清學檢測

　　利用抗原與抗體在體外或體內均能發生特異性結合的特性設計的檢測抗原或抗體的一系列檢測技術，均稱為免疫學檢測技術。由于在體外進行反應時，一般采用含有抗體的血清進行試驗，故稱為血清學技術，它具有特異性強，敏感性高，適應面廣，方法簡便快速，制樣簡單等特點。下面介紹一些常用的AIV血清學檢測技術。

　　1.2.1血凝（HA）與血凝抑制（HI）試驗：AIV的囊膜表面具有血凝素（HA）能凝集多種動物的紅細胞，這種凝集特性能被特異的血清抑制。HA試驗主要用于AIV的常規檢測，HI試驗可用于AIV的鑒定和血清中AIV抗體濃度的測定。

　　1.2.2瓊脂擴散試驗（AGP）：瓊脂凝膠的孔徑約85nm，允許抗原抗體在凝膠中自由擴散，形成濃度梯度，當抗原抗體在比例適當處相遇，形成抗原抗體復合物后在凝膠中不能再擴散，從而形成肉眼可見的沉淀線。通常用于檢測抗A型流感病毒核蛋白（NP）和基質蛋白（MP）抗體。

　　1.2.3免疫熒光(IF)技術：熒光色素（常用異硫氰酸熒光素）與抗體分子結合后，并不影響抗體蛋白分子的免疫活性，可與標本中特異性抗原特異性結合，且這種結合較為牢固，用緩沖液洗滌時除去游離的熒光素標記抗體后，用熒光顯微鏡觀察。此技術最早用于鑒定和定位流感病毒感染細胞中特異性的抗原，主要是NP或MP抗原。檢測NP抗原主要出現核內熒光，檢測MP抗原主要出現胞漿熒光，核內也有部分熒光。

　　1.2.4酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：抗原和抗體能與固相載體表面結合并能保持其免疫活性，抗原或抗體與酶結合后的標記物既能保持抗原或抗體的免疫活性，又能保持酶的活性，受檢物中的抗原或抗體與固相表面的抗體或抗原發生免疫反應并結合在固相表面，此抗原抗體復合物又能結合相應的酶標記物，洗滌除去未結合的酶標記物，加入酶反應的底物，底物被酶催化為有色產物，顯色的程度與受檢物的抗原或抗體的含量直接相關，可根據顯色的深淺進行定性和定量測定。

　　其中，間接ELISA試驗是使用酶標第二抗體的ELISA，用來檢測抗原或血清中的抗體，酶標抗體在一定條件下可以通用。本法的主要缺點是陰性背景較高，因待檢血清中特異性抗體只占總抗體的極少一部分，檢測抗原時所用的第一抗體也多為非親和層析純，其特異性抗體也只占總抗體的少部分，這樣在溫浴反應中少量非特異性抗體就有可能黏附在固相載體上，造成陰性背景過高。夾心ELISA試驗是以雙抗原夾心法檢測抗體或以雙抗體夾心法檢測抗原。檢測抗體時，要制備酶標抗原，但多數抗原的酶標效果并不理想，加上抗原的純化較難，回收率較低，故用雙抗原夾心法檢測抗體有時顯色不好，成本又高。檢測抗原時，因抗體純化步驟相對簡單，抗體的酶標效果很好，現有許多商品化的酶標抗體出售。夾心ELISA具有陰性背景低、特異性強等優點，商品化的試劑盒多采用夾心ELISA系統。

　　1.3分子生物學檢測

　　1.3.1聚合酶鏈式反應（PCR）及反轉錄—聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：是一種在體外由引物介導的DNA序列酶促合成反應，在體外擴增核酸序列，一般可擴增至106倍。主要是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性模仿體內的復制過程，在附加的一對引物之間誘發聚合反應，對于RNA病毒，必須用反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNA拷貝，然后再用PCR進行擴增，該技術稱為RT-PCR。用RT-PCR核蛋白反轉錄引物來鑒定AIV，用H5和H7亞型AIV的特定引物進行AIV分型鑒定，這些方法的標準程序已經建立，并已獲得國際社會認可。AIV HA基因裂解位點的毒力相關結構區，可作為A型流感病毒毒力鑒定的可靠指標。

　　1.3.2熒光RT-PCR：熒光RT-PCR是20世紀90年代末發展起來的新技術，將熒光素標記的探針與引物一起在熒光PCR儀中反應，電腦對整個反應進行實時監測。AI熒光RT-PCR檢測試劑盒系列包括AIV通用型及H5、H7、H9亞型AIV檢測試劑盒。與普通RT-PCR比較，在以下幾個方面有非常明顯的優勢。快速：該方法對PCR產物進行實時監控，PCR結束后即可獲得結果，省卻了電泳和EB染色，加上采用了毛細管PCR技術的ROCHE熒光PCR儀，使整個PCR過程只需4h；靈敏：由于采用了特異性的熒光探針和高靈敏度的熒光PCR儀，使該方法的靈敏度提高了100-1000倍，對于AIV尿囊液，稀釋至10-7仍可檢出，接近雞胚病毒分離的敏感性；特異：AIV熒光RT-PCR試劑盒采用全封閉反應，杜絕了PCR產物的氣溶膠污染。

　　1.3.3基于核苷酸序列擴增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)法：是以轉錄為基礎的擴增系統，用來檢測RNA病毒，可以在一種混合物和一個溫度下進行連續的擴增。具有如下優點，快速：整個核苷酸分離、擴增和檢測過程只需6h；靈敏：不僅能檢測出具有感染性的完整的病毒顆粒，還能檢測出非感染性的和錯誤包裝的非感染性的病毒粒子，AIV尿囊液稀釋至10-7仍可以檢出；高特異性：不需要常規PCR中的模板變性，能特異的擴增單鏈的RNA病毒；無交叉污染：由于NASBA的終產物是RNA，RNA對環境是不穩定的，交叉污染的可能性極小。

　　1.4掃描電子顯微鏡(SEM)技術

　　SEM的電磁線圈起透鏡的作用，電子束經電磁線圈聚焦在覆有薄層重金屬膜的樣品上，檢測器測量從樣品每一點發射或散射出來的電子數量，用于控制屏幕圖像上每一點的強度，這種顯微鏡有很大的焦深，能為三維物體形成鮮明的圖像，其分辨率為3~20nm，視儀器而定。流感病毒具有多形性，在病毒遺傳學研究中作為一種遺傳標志，典型A型流感病毒粒子呈球形，直徑80~120nm，AIV有些毒株主要為球形，而有些毒株為多形性，并且大小差別很大。通過SEM可以觀察到AIV的形態，病毒粒子表面纖突的結構以及裂解病毒釋放出的內容物，還可以對病毒在體內的分布、增殖情況與其它病毒形態差別有感性認識。

　　用雞胚進行病原分離和用易感雞做攻毒試驗確定致病性，雖然是一種經典方法，但比較耗費時間，且花費也較高，對于疑似HPAI需要在48h內做出確切診斷來說 ，則不大合適。HA與HI試驗是AIV的一種常規的檢測方法，但僅能確定病毒亞型，且紅細胞濃度、稀釋液、反應的溫度、加抗原與加紅細胞之間的時間間隔及結果的判定標準均會影響試驗結果，而且HI試驗需預處理血清中的非特異性血凝抑制因子。AGP操作簡便、但敏感性較差，且最早檢出的時間較晚，不易及時掌握疫情。IF結果直觀，但它缺乏一個客觀終點，也不可能使之自動化，或在大批量的標本中使用。掃描電子顯微鏡技術需要電子顯微鏡設備且處理樣品較繁瑣不便于一次大量檢測，且花費較高，臨床診斷中很少使用。