目前，小肽營養(yǎng)已成為蛋白質(zhì)營養(yǎng)理論研究的焦點之一。但現(xiàn)在進行小肽理論研究的難點是缺乏合適的肽制品，以及合理有效的鑒定肽制品的方法。為解決這一問題，本試驗利用胰酶水解酪蛋白法生產(chǎn)小肽，并對產(chǎn)品質(zhì)量進行初步鑒定。

l生產(chǎn)原料

酪蛋白：為試劑級干酪素，經(jīng)半自動凱氏定氮儀測定含氮量為13.53％。

胰酶：取自豬的胰臟，通過特殊生物化學(xué)方法制備而成，其中包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、氨肽酶和按肽酶等。

2生產(chǎn)步驟

2．l酪蛋白溶液配制    酪蛋白原料經(jīng)粉碎后倒入帶夾層的不銹鋼反應(yīng)鍋中，加入5％醋酸溶液浸沒酪蛋白，浸泡24h以溶解其中的酸可溶性物質(zhì)，隨后將醋酸從包有多層紗布的底部排水管中排出，然后注入去離子水反復(fù)浸泡。徹底沖洗殘留的醋酸至溶液的pH為中性，添加會離子水使酷蛋白和水的重量比約為1∶20，隨后在雙層反應(yīng)鍋的夾層中通入熱蒸汽，升高鍋內(nèi)水溫至80℃，然后打開反應(yīng)鍋內(nèi)的自動攪拌器，邊攪拌邊緩慢加入10％ NaOH溶液，調(diào)溶液pH為8.0，連續(xù)攪拌直至反應(yīng)鍋內(nèi)的酪蛋白完全溶解。

加熱和加堿的目的是：l）殺滅溶液中的細(xì)菌，防止在酶解過程中細(xì)菌繁殖而降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)價值；2）由于酪蛋白通常情況下不溶于水，但可以溶于熱堿溶液中，故加入NaOH溶液可以起到助溶作用；3）熱和堿作用可使酪蛋白發(fā)生變性，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，肽鏈間化學(xué)鍵發(fā)生斷裂，更易于被蛋白酶分解；4）調(diào)整酷蛋白溶液的pH，使胰酶可以發(fā)揮最大生物活性。

2．2酶解反應(yīng)    維持反應(yīng)鍋內(nèi)溶液80℃的溫度至少半小時，然后由夾層通入自來水降低鍋內(nèi)溶液溫度至 50 ℃，按 1∶30的酶／底物比加入需要量的胰酶，在攪拌器連續(xù)攪拌下開始酶解反應(yīng)，期間調(diào)整通入反應(yīng)鍋夾層的蒸汽量使溫度維持在50℃。酶解反應(yīng)過程中，特別是酶解反應(yīng)前期，由于胰酶的水解作用，釀蛋白不斷地被分解生成多肽，多肽繼續(xù)被分解成為短鏈的肽，甚至在按肽酶或氨肽酶作用下生成少量游離氨基酸。由于多肽、小肽或氨基酸為兩性電解質(zhì)，等電點多數(shù)偏酸性，所以在反應(yīng)過程中，隨生成的肽逐漸增多整個反應(yīng)體系的pH值會不斷降低，為保證胰酶的最大生物活性使反應(yīng)液的pH維持在8．0，這就需要不斷在反應(yīng)液中加入NaOH稀溶液。自加入胰酶起6h后酶解反應(yīng)結(jié)束。此時，加大蒸汽的通入量使酶解液升溫至 80℃維持30min，其作用有二：一是將胰酶滅活以終止酶解反應(yīng)；二是再次殺滅反應(yīng)液中雜菌防止在隨后的處理過程中細(xì)菌增殖。

2．3過濾處理    酶解反應(yīng)液分別經(jīng)板框壓濾機和微濾壓縮機過濾。板框壓濾機的濾膜是由兩層厚棉紗布強化固定的加厚濾紙，微濾壓縮機中采用過濾孔徑為0.5μm石英濾芯，二者過濾除去反應(yīng)液中較大粒度的胰酶制劑顆粒。使用板框壓濾機前，先用蒸餾水從過濾液進口通道壓入清水，保證除濾清液出口外沒有水從其他處漏出，以證明板框壓濾機狀況良好。使用微濾壓縮機前，先將石英濾芯放于5％ NaOH稀溶液中進行清洗，然后用蒸餾水沖凈，以保證最好的過濾效果。

2.4脫鹽處理     在過濾后的酶解液中加入10％鹽酸進行中和，調(diào)節(jié)酶解液至中性。為了促進酪蛋白溶解，或酶解過程中為維持酶解反應(yīng)液pH值的穩(wěn)定，加入了相當(dāng)量的NaOH，隨后被鹽酸中和轉(zhuǎn)化成大量的氯化鈉，氯化鈉占酪蛋白重量比超過了10％，超出了動物所能承受的限量，所以必須在酶解液進行噴霧干燥前采用離子交換樹脂進行脫鹽處理。本試驗采用強酸型聚苯乙烯陽離子交換樹酯（ 001×7型）和強堿型聚苯乙烯陰離子交換樹酯（201× 7型）裝成樹脂柱進行脫鹽處理。

2．5濃縮、干燥處理    酶解液經(jīng)脫鹽后，經(jīng)真空濃縮泵進行真空低溫濃縮，使溶液中大量的水分在真空低壓下蒸發(fā)，隨后經(jīng)干燥塔噴霧干燥，最后得到胰酶水解酪蛋白法生產(chǎn)的小肽制品。

3所得小肽制品的質(zhì)量檢驗分析

3．l含氮量測定     采用半自動凱氏定氮儀進行氮含量測定，測定結(jié)果為含氮13．3472 ％。

3．2氨基氮測定    采用甲醛滴定法。稱取約10g小肽制品用蒸餾水溶解，定容至 1000 mL容量瓶中，取10 mL于燒杯中，并加入20 mL蒸餾水，電磁攪拌器攪拌，在pH計指示下用NaOH滿定（M＝ 0．05 mmol／mL）至pH 8．2，再加入 10 mL中性甲醛溶液，攪拌1min后重新滴定至溶液pH為9．2。記錄第二次摘定消耗的NaOH溶液體積V₁，用蒸餾水作空白進行滴定，記錄消耗的NaOH溶液體積V₀。

    酪蛋白酶解液中的氨基氮量 N（mmol）＝ M（V₁-V₀），測定結(jié)果酪蛋白酶解液中氨基氮N＝M（V₁- V₀）＝ 0．2237（mmol）。

3．3水解度測定    酪蛋白的水解度DH＝（N／W－0．45）／8．2，其中 W為 10mL滴定液中的小肽制品所相對應(yīng)的釀蛋白量。釀蛋白量W＝W_肽×0．133472÷0.15674＝0．0854，其中W_肽為所滴定溶液中的小肽制品的重量，0．133472為單位重量小肽制品中氮含量，0．15674指單位重量純酪蛋白中氮含量。

測定結(jié)果：酪蛋白的水解度DH（%）＝（N／W－0．45）／8．2 ×1 00＝26．45，平均肽鏈長度L＝100／26．45＝3．78。

3．4氨基酸含量分析    采用德國安米諾西斯（aminoSys）公司生產(chǎn) Amimo  Acid  Analyzer Al00進行氨基酸分析。

總氨基酸分析：取一定重量的小肽制品經(jīng)水解后進行氨基酸測定，其中堿水解處理法分析色氨酸含量，過甲酸氧化處理法測定脫氨酸，其余氨基酸以6 M Hcl水解采用常規(guī)蛋白質(zhì)水解物的洗脫程序進行分析、測定。將測定樣中各氨基酸重量除以樣品中氨基酸總重量，得到各氨基酸在總氨基酸中的比例。測定結(jié)果見表1。

表1  小肽制品中總氨基酸及游離氨基酸比例

3．5含水量測定   稱取約2g  小肽制品，放入預(yù)先經(jīng)105℃高溫恒重的培養(yǎng)皿中，在烘箱中繼續(xù)加熱至小肽制品成恒重后，計算肽制品的含水量。計算公式：H_樣品=（W_樣重一W_烘干重）／w_樣重，測定結(jié)果：H_樣品=5．634％。

3．6寡肽含量測定    稱取約5g小肽制品，溶于盛有 500 mL蒸餾水的 1000 mL燒杯中，將燒杯與中空纖維超濾器連接，超濾器的原液輸入管和濃縮液輸出管均在燒杯中構(gòu)成一個液體循環(huán)體系，調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速使超濾器中空纖維柱的工作壓力保持在0．l－0．2 MPa，蠕動泵將肽溶液壓至中空纖維柱中，中空纖維柱的孔徑大小允許分子量小于1000 Da的寡肽分子通過，寡肽小分子在壓力下可通過往壁孔徑形成超濾液流出，分子量大于 11 Da的大肽不能通過纖維柱孔徑，只能順纖維柱柱芯流動，最后以濃縮液形式返流回?zé)瓋?nèi)，經(jīng)過蠕動泵的連續(xù)轉(zhuǎn)動，燒杯中的肽原液不斷通過中空纖維柱的超濾作用，使原液最后被分為濃縮液（溶質(zhì)為分子量大于1000 Da的大肽）和超濾液（溶質(zhì)為分子量小于 1000 Da的寡肽和游離氨基酸的混合物）。先將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的盛液瓶在105℃烘箱中烘至恒重，然后將超濾液導(dǎo)入其中進行減壓濃縮，最后放入105℃烘箱中烘至恒重，其中干物質(zhì)是分子量小于1000 Da的寡肽和游離氨基酸的混合物，再計算出混合物中的游離氨基酸重量，即可確定出肽產(chǎn)品中的寡肽比例。

計算公式：樣品中寡肽比例T寡肽=（W_寡肽+FAA-W_FAA）／（W_肽樣一 H_樣品 × W_肽樣）。其中W_寡肽+FAA為寡肽與游離氨基酸混合物重； W_FAA為游離氨基酸重， W_FAA＝ 0．0502×W_肽樣；W_肽樣為樣品重量；H_樣品為小肽制品含水比例。

結(jié)果見表2

表2小肽制品中水分、

游離氨基酸、寡聯(lián)和大聯(lián)含量  %

   （參考文獻(xiàn)略）