飼料中維生素B1測定方法
來源: 作者: 時間: 2012-12-25
1 主題內(nèi)容與適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中維生素B1的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、維生素預(yù)混料中維生素B1的測定。萃取液的濃度范圍為0.02～0.2μg/mL（在有吸附硫胺素或影響硫色素?zé)晒飧蓴_物質(zhì)的情況下，本標(biāo)準(zhǔn)不適用）。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
GB 6682 實驗室用水規(guī)格
3 方法原理
試樣中的維生素B1（即硫胺素C12H17ON4SCl）經(jīng)稀酸消化、酶分解、吸附劑的吸附分離提純后，在堿性條件下被鐵氰化鉀氧化生成熒光色素——硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的熒光強(qiáng)度與試樣中維生素B1的含量成正比，依此進(jìn)行定量測定。
4 試劑和溶液
除特殊規(guī)定外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或相應(yīng)純度的水。
4.1 鹽酸溶液，0.1mol/L：將8.5mL鹽酸（GB 622）用水稀釋至1000mL。
4.2 硫酸溶液，0.05mol/L：將2.8mL濃硫酸（GB 625）加入水中，稀釋至1000mL。
4.3 乙酸鈉溶液，2.0mol/L：取164g無水乙酸鈉（GB 694）或272g結(jié)晶乙酸鈉（CH2COONa·3H2O GB 693）溶于水，稀釋至1000mL。
4.4 淀粉酶懸浮液，100g/L：用2.0mol/L乙酸鈉溶液（4.3）懸浮10g淀粉酶制劑（Takadiastase，或相當(dāng)活性的其他磷酸酯酶），稀釋至100mL，使用當(dāng)日制備。
4.5 氯化鉀（GB 646）溶液，250g/L。
4.6 酸性氯化鉀溶液：將8.5mL濃鹽酸加入至氯化鉀溶液（4.5）中，慚稀釋至1000mL。
4.7 氫氧化鈉（GB 629）溶液，150g/L。
4.8 鐵氰化鉀（GB 644）溶液，10g/L。
4.9 堿性鐵氰化鉀溶液：4.0mL的鐵氰化鉀溶液（4.8）與氫氧化鈉溶液（4.7）混合使之成100mL，此液4h內(nèi)使用。
4.10 冰乙酸（GB 676）溶液，30mL/L。
4.11 人造沸石（Q/HG 12-445-63，60～80目）使用前必需活化，方法如下：
將適量人造沸石置于大燒杯中，加入10倍容積的熱乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均勻攪動10min，使沸石在乙酸溶液中懸浮，待沸石沉降后，棄去上層乙酸液。重復(fù)上述操作兩次。換用5倍其容積的熱氯化鉀溶液（4.5）攪動清洗兩次，每次15min。再用熱乙酸溶液洗10min。最后用熱蒸餾水清洗沸石至無氯離子（用10g/L硝酸銀水溶液檢驗）。用布氏漏斗抽濾，100℃烘干，貯于磨口瓶中備用。使用前，檢查沸石對硫胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率，如達(dá)不到 92%，需重新活化沸石。
4.12 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液
4.12.1 硫胺素貯備液Ⅰ：鹽酸硫胺素純品（中國藥典參照標(biāo)準(zhǔn)），于五氧化二磷干燥器24h，稱取0.0500g，溶解于ph4.5～4.3的20%（V/V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升含0.1mg硫胺素。
4.12.2 硫胺素貯備液Ⅱ：取硫胺素貯備液Ⅰ（4.12.1）10mL用酸性20%乙醇溶液定容至100mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升中含10μg硫胺素。
4.12.3 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液：取貯備液Ⅱ（4.12.2）2mL與65mL鹽酸溶液（4.1）和5mL乙酸鈉溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。該溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。
4.13 硫酸奎寧（Q/HG 22-797-68）溶液
4.13.1 硫酸奎寧貯備液：稱取硫酸奎寧0.1000g，用0.05mol/L硫酸（4.2）溶解并定容至1000mL，貯于棕色瓶中低溫保存。若溶液混濁則需重新配制。該溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎寧。
4.13.2 硫酸奎寧工作液：取貯備液（4.13.1）3mL，用0.05mol/L硫酸定容至 1000mL，盛于棕色瓶中，低溫保存。該溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎寧。
4.14 正丁醇（HG 3-1012），其熒光強(qiáng)度不超過硫酸奎寧工作液的4%，否則需用全玻璃蒸餾器重蒸餾，取114℃～118℃餾份。
4.15 無水硫酸鈉（HG 3-123）。
5 儀器、設(shè)備
5.1 熒光分光光度計，備1cm石英比色杯。
5.2 電熱恒溫水浴。
5.3 電熱恒溫箱。
5.4 實驗室用樣品粉碎機(jī)。
5.5 分析天平：感量0.0001g。
5.6 注射器：10mL。
5.7 吸附分離柱：全長235mm，外徑×長度如下：
上端貯液槽容量約為50mL，35mm×70mm；中部吸附管8mm×130mm；下端35mm；下端35mm拉成毛細(xì)管。
5.8 反應(yīng)瓶：具塞離心管25mL。
6 試樣的制備
選取有代表性的飼料樣品，至少500g，四分法縮減至100g，磨碎，過0.28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?nbsp;
7 分析步驟
7.1 稱樣：稱取單一飼料、配合飼料或濃縮飼料1～2g（約含硫胺素4～20μg），精確至0.001g。維生素預(yù)混料0.25～0.5g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中。
7.2 提取
7.2.1 水解：將0.1mol/L鹽酸（4.1）65mL加入試樣瓶（7.1）中，經(jīng)沸水浴加熱30min，開始加熱5～10min內(nèi)不時搖動容量瓶，以防結(jié)塊?；蛴?21℃～123℃15磅高壓釜中加熱30min。
7.2.2 酶解：冷卻容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶懸浮液（4.4），搖勻。該試液的pH約為4.0～4.5，將容量瓶于45℃～50℃恒溫箱中保溫3h，取出冷卻調(diào)整pH4.5，用水稀釋至100mL。
7.2.3 過濾：將試液通過無灰濾紙過濾棄去初濾液5mL，收集濾液于錐形瓶中。預(yù)混料提取液需逐級稀釋，使之含硫胺素約為0.2μg/mL。
7.3 提純
7.3.1 制備吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小燒杯中，加入3%乙酸溶液（4.10）浸泡。將脫脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒輕壓。然后將乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脫水），過柱流速≤1mL/min為宜。再用10mL近沸的洗柱一次。
7.3.2 吸25mL提取液（7.2.3），慢慢加入制備好的吸附柱中，棄去濾液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，棄去洗液。
7.3.3 用25mL 60℃～70℃酸性氯化鉀（4.6）分三次連續(xù)加入吸附柱，收集洗脫液于25mL容量瓶中，冷卻后用酸性氯化鉀定容，混勻。
7.3.4 同時用25mL硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.12.3）。重復(fù)7.3.1～7.3.3操作，作為外標(biāo)。
7.4 氧化與萃取（以下操作避免紫外光照射）
7.4.1 于兩只反應(yīng)管中各吸入5mL洗脫液（7.3.3），記作A、B。
7.4.2 向B管加3mL氫氧化鈉溶液（4.7），再向A管中加3mL氧化劑堿性鐵氰化鉀溶液（4.9），輕輕旋搖。依次立即向A管加15mL正丁醇加塞，劇烈地振搖15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共同振搖90s，靜置分層。
7.4.3 用注射器吸去下層水相，向各反應(yīng)管加入約2g無水硫酸鈉（4.15），旋搖，待測。
7.4.4 同時將5mL作為外標(biāo)的洗脫液（7.3.4），置入另兩只反應(yīng)管，相應(yīng)地記作C、D，按7.4.1～7.4.3操作。
7.5 測定
7.5.1 用硫酸奎寧工作液（4.13.2）調(diào)整熒光儀，使其穩(wěn)定于一定數(shù)值，作為儀器工作的固定條件。
7.5.2 于激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長435nm處測定各反應(yīng)管中萃取液［（7.4.3）和（7.4.4）］的熒光強(qiáng)度。
8 分析結(jié)果的計算和表述
8.1 計算公式
硫胺素（維生素B1）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式計算：
硫胺素（VB1mg/kg）＝〔（T－T0）/（S－S0）〕×C×（V2/V1）×（V0/m）
式中：T──A管試液的熒光強(qiáng)度；T0──B管試液空白的熒光強(qiáng)度；S──C管標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度；S0──D管標(biāo)準(zhǔn)溶液空白的熒光強(qiáng)度；C──硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg/mL；0──提取液總體積，mL；V1──分取提取液過柱的體積，mL；V2──酸性氯化鉀洗脫液體積，mL；m──試樣質(zhì)量，g。
8.2 平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留有效數(shù)3位。
9 重復(fù)性
同一分析者對同一試樣同時或快速連續(xù)進(jìn)行兩次測定，所得結(jié)果之間的差值；在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg時，不得超過平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg時，不得超過平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg時不得超過平均值的5%。
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中維生素B1的測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、維生素預(yù)混料中維生素B1的測定。萃取液的濃度范圍為0.02～0.2μg/mL（在有吸附硫胺素或影響硫色素?zé)晒飧蓴_物質(zhì)的情況下，本標(biāo)準(zhǔn)不適用）。
2 引用標(biāo)準(zhǔn)
GB 6682 實驗室用水規(guī)格
3 方法原理
試樣中的維生素B1（即硫胺素C12H17ON4SCl）經(jīng)稀酸消化、酶分解、吸附劑的吸附分離提純后，在堿性條件下被鐵氰化鉀氧化生成熒光色素——硫色素，用正丁醇萃取。硫色素在正丁醇中的熒光強(qiáng)度與試樣中維生素B1的含量成正比，依此進(jìn)行定量測定。
4 試劑和溶液
除特殊規(guī)定外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或相應(yīng)純度的水。
4.1 鹽酸溶液，0.1mol/L：將8.5mL鹽酸（GB 622）用水稀釋至1000mL。
4.2 硫酸溶液，0.05mol/L：將2.8mL濃硫酸（GB 625）加入水中，稀釋至1000mL。
4.3 乙酸鈉溶液，2.0mol/L：取164g無水乙酸鈉（GB 694）或272g結(jié)晶乙酸鈉（CH2COONa·3H2O GB 693）溶于水，稀釋至1000mL。
4.4 淀粉酶懸浮液，100g/L：用2.0mol/L乙酸鈉溶液（4.3）懸浮10g淀粉酶制劑（Takadiastase，或相當(dāng)活性的其他磷酸酯酶），稀釋至100mL，使用當(dāng)日制備。
4.5 氯化鉀（GB 646）溶液，250g/L。
4.6 酸性氯化鉀溶液：將8.5mL濃鹽酸加入至氯化鉀溶液（4.5）中，慚稀釋至1000mL。
4.7 氫氧化鈉（GB 629）溶液，150g/L。
4.8 鐵氰化鉀（GB 644）溶液，10g/L。
4.9 堿性鐵氰化鉀溶液：4.0mL的鐵氰化鉀溶液（4.8）與氫氧化鈉溶液（4.7）混合使之成100mL，此液4h內(nèi)使用。
4.10 冰乙酸（GB 676）溶液，30mL/L。
4.11 人造沸石（Q/HG 12-445-63，60～80目）使用前必需活化，方法如下：
將適量人造沸石置于大燒杯中，加入10倍容積的熱乙酸溶液（4.10），用玻璃棒均勻攪動10min，使沸石在乙酸溶液中懸浮，待沸石沉降后，棄去上層乙酸液。重復(fù)上述操作兩次。換用5倍其容積的熱氯化鉀溶液（4.5）攪動清洗兩次，每次15min。再用熱乙酸溶液洗10min。最后用熱蒸餾水清洗沸石至無氯離子（用10g/L硝酸銀水溶液檢驗）。用布氏漏斗抽濾，100℃烘干，貯于磨口瓶中備用。使用前，檢查沸石對硫胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率，如達(dá)不到 92%，需重新活化沸石。
4.12 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)溶液
4.12.1 硫胺素貯備液Ⅰ：鹽酸硫胺素純品（中國藥典參照標(biāo)準(zhǔn)），于五氧化二磷干燥器24h，稱取0.0500g，溶解于ph4.5～4.3的20%（V/V）乙醇溶液中并定容至500mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升含0.1mg硫胺素。
4.12.2 硫胺素貯備液Ⅱ：取硫胺素貯備液Ⅰ（4.12.1）10mL用酸性20%乙醇溶液定容至100mL，盛于棕色瓶中低溫保存。該溶液每毫升中含10μg硫胺素。
4.12.3 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液：取貯備液Ⅱ（4.12.2）2mL與65mL鹽酸溶液（4.1）和5mL乙酸鈉溶液（4.3）混合，用水定容至100mL。現(xiàn)用現(xiàn)配。該溶液每毫升中含0.2μg硫胺素。
4.13 硫酸奎寧（Q/HG 22-797-68）溶液
4.13.1 硫酸奎寧貯備液：稱取硫酸奎寧0.1000g，用0.05mol/L硫酸（4.2）溶解并定容至1000mL，貯于棕色瓶中低溫保存。若溶液混濁則需重新配制。該溶液每毫升中含0.1mg硫酸奎寧。
4.13.2 硫酸奎寧工作液：取貯備液（4.13.1）3mL，用0.05mol/L硫酸定容至 1000mL，盛于棕色瓶中，低溫保存。該溶液每毫升中含0.3μg硫酸奎寧。
4.14 正丁醇（HG 3-1012），其熒光強(qiáng)度不超過硫酸奎寧工作液的4%，否則需用全玻璃蒸餾器重蒸餾，取114℃～118℃餾份。
4.15 無水硫酸鈉（HG 3-123）。
5 儀器、設(shè)備
5.1 熒光分光光度計，備1cm石英比色杯。
5.2 電熱恒溫水浴。
5.3 電熱恒溫箱。
5.4 實驗室用樣品粉碎機(jī)。
5.5 分析天平：感量0.0001g。
5.6 注射器：10mL。
5.7 吸附分離柱：全長235mm，外徑×長度如下：
上端貯液槽容量約為50mL，35mm×70mm；中部吸附管8mm×130mm；下端35mm；下端35mm拉成毛細(xì)管。
5.8 反應(yīng)瓶：具塞離心管25mL。
6 試樣的制備
選取有代表性的飼料樣品，至少500g，四分法縮減至100g，磨碎，過0.28mm孔篩，混勻，裝入密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆谩?nbsp;
7 分析步驟
7.1 稱樣：稱取單一飼料、配合飼料或濃縮飼料1～2g（約含硫胺素4～20μg），精確至0.001g。維生素預(yù)混料0.25～0.5g，精確至0.0001g，置于100mL容量瓶中。
7.2 提取
7.2.1 水解：將0.1mol/L鹽酸（4.1）65mL加入試樣瓶（7.1）中，經(jīng)沸水浴加熱30min，開始加熱5～10min內(nèi)不時搖動容量瓶，以防結(jié)塊?；蛴?21℃～123℃15磅高壓釜中加熱30min。
7.2.2 酶解：冷卻容量瓶至50℃以下，加5mL淀粉酶懸浮液（4.4），搖勻。該試液的pH約為4.0～4.5，將容量瓶于45℃～50℃恒溫箱中保溫3h，取出冷卻調(diào)整pH4.5，用水稀釋至100mL。
7.2.3 過濾：將試液通過無灰濾紙過濾棄去初濾液5mL，收集濾液于錐形瓶中。預(yù)混料提取液需逐級稀釋，使之含硫胺素約為0.2μg/mL。
7.3 提純
7.3.1 制備吸附柱：取1.5g活化人造沸石（4.11）置于50mL小燒杯中，加入3%乙酸溶液（4.10）浸泡。將脫脂棉置于吸附柱底部，用玻璃棒輕壓。然后將乙酸浸泡的沸石全部洗入柱中（勿使吸附柱脫水），過柱流速≤1mL/min為宜。再用10mL近沸的洗柱一次。
7.3.2 吸25mL提取液（7.2.3），慢慢加入制備好的吸附柱中，棄去濾液，用每份5mL近沸的水洗柱三次，棄去洗液。
7.3.3 用25mL 60℃～70℃酸性氯化鉀（4.6）分三次連續(xù)加入吸附柱，收集洗脫液于25mL容量瓶中，冷卻后用酸性氯化鉀定容，混勻。
7.3.4 同時用25mL硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.12.3）。重復(fù)7.3.1～7.3.3操作，作為外標(biāo)。
7.4 氧化與萃取（以下操作避免紫外光照射）
7.4.1 于兩只反應(yīng)管中各吸入5mL洗脫液（7.3.3），記作A、B。
7.4.2 向B管加3mL氫氧化鈉溶液（4.7），再向A管中加3mL氧化劑堿性鐵氰化鉀溶液（4.9），輕輕旋搖。依次立即向A管加15mL正丁醇加塞，劇烈地振搖15s，再向B管加入15mL正丁醇加塞。共同振搖90s，靜置分層。
7.4.3 用注射器吸去下層水相，向各反應(yīng)管加入約2g無水硫酸鈉（4.15），旋搖，待測。
7.4.4 同時將5mL作為外標(biāo)的洗脫液（7.3.4），置入另兩只反應(yīng)管，相應(yīng)地記作C、D，按7.4.1～7.4.3操作。
7.5 測定
7.5.1 用硫酸奎寧工作液（4.13.2）調(diào)整熒光儀，使其穩(wěn)定于一定數(shù)值，作為儀器工作的固定條件。
7.5.2 于激發(fā)波長365nm，發(fā)射波長435nm處測定各反應(yīng)管中萃取液［（7.4.3）和（7.4.4）］的熒光強(qiáng)度。
8 分析結(jié)果的計算和表述
8.1 計算公式
硫胺素（維生素B1）含量以mg/kg（或g/kg）表示，按下式計算：
硫胺素（VB1mg/kg）＝〔（T－T0）/（S－S0）〕×C×（V2/V1）×（V0/m）
式中：T──A管試液的熒光強(qiáng)度；T0──B管試液空白的熒光強(qiáng)度；S──C管標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度；S0──D管標(biāo)準(zhǔn)溶液空白的熒光強(qiáng)度；C──硫胺素標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，μg/mL；0──提取液總體積，mL；V1──分取提取液過柱的體積，mL；V2──酸性氯化鉀洗脫液體積，mL；m──試樣質(zhì)量，g。
8.2 平行測定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，保留有效數(shù)3位。
9 重復(fù)性
同一分析者對同一試樣同時或快速連續(xù)進(jìn)行兩次測定，所得結(jié)果之間的差值；在硫胺素含量小于或等于5.0mg/kg時，不得超過平均值的15%。在硫胺素含量大于5.0mg/kg時，不得超過平均值的10%。在硫胺素含量大于50mg/kg時不得超過平均值的5%。
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