飼料有效賴氨酸測定方法
來源: 作者: 時間: 2012-12-25
1 主題內容與適用范圍
本標準規定了飼料中有效賴氨酸的測定方法。
本標準適用于含有動物或植物性蛋白質的配合（混合）飼料及單一飼料。
2 引用標準
GB 6432 飼料粗蛋白測定方法
3 術語
有效賴氨酸是指在規定的測定條件下測得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。
4 原理
蛋白質中有效賴氨酸的ε-氨基可與2，4-二硝基氟苯反應，酸解后生成二硝基苯賴氨酸，而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經二硝基氟苯處理的樣品和經由二硝基氟苯處理的樣品分別水解，用離子交換色譜法測定各自的賴氨酸含量，即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。
5 試劑和溶液
本標準所用試劑均為分析純，水為去離子水。
5.1 乙醚（HG 3—1002）。
5.2 碳酸氫鈉（GB 640）溶液：80g/L。
5.3 2.4-二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液：
將一定量的DNFB溶于95％乙醇，其體積比為0.15∶12，該溶液用前現配。
5.4 鹽酸（GB 622）溶液：6.0mol/L。
5.5 鹽酸（GB 622）溶液：6.5mol/L。
5.6 稀釋用檸檬酸鈉緩沖液：pH約2.2。
將下列試劑依次溶于適量水：
20g水合檸檬酸（HG 3—1108）
8g氫氧化鈉（GB 629）
16mL濃鹽酸（GB 622）
0.1mL辛酸
20mL硫二甘醇
加水稀釋至1000mL。
5.7 層析用檸檬酸鈉緩沖液：
pH值及配制方法依不同型號的氨基酸測定儀有所區別，請參見儀器說明書配制。
5.8 茚三酮試劑
按儀器說明書配制。
5.9 賴氨酸標準液：50nmol/mL或其他濃度。
先配制2.5μmol/mL賴氨酸標準貯備液：稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中，稀釋至100mL，混勻。
用該標準貯備液或商品2.5μmol/mL的標準氨基酸混合液，以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標準液。也可根據儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。
6 儀器、設備
6.1 實驗室用樣品粉碎機：能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。
6.2 樣品篩：孔徑0.25mm（60目）。
6.3 分析天平：感量0.0001g。
6.4 油浴：溫度可穩定于120～130℃之間。
6.5 回流水解裝置：150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器（長約35～40cm）相接。
6.6 離心機：4000r/min。
6.7 旋轉蒸發器。
6.8 氨基酸自動分析儀。
6.9 回流水解裝置：50mL水解管或消煮管，具磨口接頭與回流冷凝器相接。
6.10 金屬塊消煮爐：要求溫度保持在120～130℃之間，必要時可加繼電器和接點溫度計控制。金屬塊內消煮管的受熱深度應高于或等于25mL消煮液的液面高度。
6.11 水浴
7 試樣制備
采集具代表性的配合（混合）飼料或單一飼料，按四分法縮分制備實驗室樣品，取10～20g粉碎，使其全部通過樣品篩（6.2）。充分混勻，裝入密閉容器。
8 分析步驟
8.1 A法
8.1.1 總賴氨酸
8.1.1.1 酸水解
稱取約含50mg粗蛋白質的樣品兩份，置于500mL燒瓶（6.5）中，加入250mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器，置120～130℃油浴（6.4）中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。必要時將酸解液（連同水解后不溶物）重新定容至250mL。過濾，吸取5mL濾液，于旋轉蒸發器（6.7）上，60℃左右蒸發至干。加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于5mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），離心10min（4000r/min），取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.1.2 測定
打開氨基酸自動分析儀（6.8），使柱溫，反應浴溫度，緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數達到預定要求，并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標準液（5.9）進行校準。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進行測定。
8.1.2 非有效賴氨酸
8.1.2.1 二硝基苯化反應
稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份，置于150mL燒瓶（6.5）中，加入4mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min，其間需不時振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液（5.3），加蓋，振搖，注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。
8.1.2.2 純化
在旋轉蒸發器上，溫度不高于40℃條件下，將上述反應物蒸干，加入35mL乙醚（5.1），振搖或攪拌后，待固體充分沉降，棄去絕大部分乙醚，小心不要帶出固體樣品顆粒。重復上述操作兩次，每次加25mL乙醚（此步驟乙醚層有時似較渾濁，只要傾倒時不帶出樣口顆粒，可不必離心）。最后，蒸發除去殘存乙醚。
8.1.2.3 酸水解
邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸（5.4），使樣品全部浸于酸中，裝好回流冷凝器，置于120～130℃油浴中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。將水解物定量轉移至100mL容量瓶中，用水定容，過濾。吸取5mL濾液于旋轉蒸發器上，60℃左右蒸發至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于3mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），用離心機（6.6）離心10min，取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.2.4 測定
同8.1.1.2。
非有效賴氨酸峰值較低，易受鄰峰或雜峰干擾，如某些氨基酸自動分析儀該峰分離不好，需將樹脂床（或分析柱）加長，或變換參數與程序。
8.2 B法──簡化法
8.2.1 總賴氨酸
準確稱取約含50mg粗蛋白質的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入25mL 鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器并置于預先熱至120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，緩緩煮沸水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液2mL，于旋轉蒸發器，60℃濃縮至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），（粗蛋白質含量為10％～20％的樣品加2mL，粗蛋白質含量為30％～50％的加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
8.2.2 非有效賴氨酸
8.2.2.1 二硝基苯化反應
稱取約含蛋白質20～25mg的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入2mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min（其間不時振搖），加入DNFB乙醇溶液（5.3）3mL，振搖混勻后，在室溫下暗處放置過夜。
將上述水解管置85～90℃水浴中蒸去乙醇，直至振搖時不產生泡沫為止。此時水解管內物應失重2.5～3g。
8.2.2.2 純化
于去醇后的水解管內加入2mL乙醚（5.1），加塞，劇烈振搖后令其分層，棄去乙醚層，再用乙醚萃取兩次，每次10mL，棄去醚層后，將水解管放入60～70℃水浴，除去殘存乙醚。
8.2.2.3 酸水解
邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸（5.5）裝好冷凝器，與測總賴氨酸樣品一道置120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，回流水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉蒸發器上蒸發至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6）（蛋白質含量10％～20％加3mL，30％～50％加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
9 分析結果的表述
9.1 總賴氨酸
樣品中總賴氨酸含量W1，以其質量百分率表示，即：
………………………………（1）
式中：A── 每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m1── 樣品質量，mg；
D── 稀釋倍數。
9.2 非有效賴氨酸
樣品中非有效賴氨酸含量W2，以其質量百分率表示，即：
………………………………（2）
式中：A── 每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m2── 非有效賴氨酸測定中樣品質量，mg；
D── 稀釋倍數。
9.3 有效賴氨酸
樣品中有效賴氨酸含量W3，以質量百分率表示，即：
有效賴氨酸W3＝W1－W2……………………………………（3）
若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質量百分率表示，則
W3（％）＝〔（W1－W2）/W1〕×100……………………（4）
10 重復性
同一試樣兩平行測定值的相對相差，應不超過其平均值的10％。
注：與生物測定法相比，本法測定結果偏高，在分析評價實驗結果時需加以注意。
本標準規定了飼料中有效賴氨酸的測定方法。
本標準適用于含有動物或植物性蛋白質的配合（混合）飼料及單一飼料。
2 引用標準
GB 6432 飼料粗蛋白測定方法
3 術語
有效賴氨酸是指在規定的測定條件下測得的總賴氨酸和非有效賴氨酸之差。
4 原理
蛋白質中有效賴氨酸的ε-氨基可與2，4-二硝基氟苯反應，酸解后生成二硝基苯賴氨酸，而其他非有效部分則生成賴氨酸。因此將不經二硝基氟苯處理的樣品和經由二硝基氟苯處理的樣品分別水解，用離子交換色譜法測定各自的賴氨酸含量，即可由其差值得出樣品中有效賴氨酸的含量。
5 試劑和溶液
本標準所用試劑均為分析純，水為去離子水。
5.1 乙醚（HG 3—1002）。
5.2 碳酸氫鈉（GB 640）溶液：80g/L。
5.3 2.4-二硝基氟苯（DNFB）乙醇溶液：
將一定量的DNFB溶于95％乙醇，其體積比為0.15∶12，該溶液用前現配。
5.4 鹽酸（GB 622）溶液：6.0mol/L。
5.5 鹽酸（GB 622）溶液：6.5mol/L。
5.6 稀釋用檸檬酸鈉緩沖液：pH約2.2。
將下列試劑依次溶于適量水：
20g水合檸檬酸（HG 3—1108）
8g氫氧化鈉（GB 629）
16mL濃鹽酸（GB 622）
0.1mL辛酸
20mL硫二甘醇
加水稀釋至1000mL。
5.7 層析用檸檬酸鈉緩沖液：
pH值及配制方法依不同型號的氨基酸測定儀有所區別，請參見儀器說明書配制。
5.8 茚三酮試劑
按儀器說明書配制。
5.9 賴氨酸標準液：50nmol/mL或其他濃度。
先配制2.5μmol/mL賴氨酸標準貯備液：稱取45.6mg賴氨酸單鹽酸鹽溶于0.1mol/L的鹽酸中，稀釋至100mL，混勻。
用該標準貯備液或商品2.5μmol/mL的標準氨基酸混合液，以pH2.2檸檬酸鈉緩沖液為溶劑配制50.0nmol/mL標準液。也可根據儀器說明書配制成其他最佳使用濃度。
6 儀器、設備
6.1 實驗室用樣品粉碎機：能快速一致地粉碎樣品并能避免樣品過熱和盡可能少與外界接觸。
6.2 樣品篩：孔徑0.25mm（60目）。
6.3 分析天平：感量0.0001g。
6.4 油浴：溫度可穩定于120～130℃之間。
6.5 回流水解裝置：150mL、500mL短頸燒瓶以玻璃磨口接頭與回流冷凝器（長約35～40cm）相接。
6.6 離心機：4000r/min。
6.7 旋轉蒸發器。
6.8 氨基酸自動分析儀。
6.9 回流水解裝置：50mL水解管或消煮管，具磨口接頭與回流冷凝器相接。
6.10 金屬塊消煮爐：要求溫度保持在120～130℃之間，必要時可加繼電器和接點溫度計控制。金屬塊內消煮管的受熱深度應高于或等于25mL消煮液的液面高度。
6.11 水浴
7 試樣制備
采集具代表性的配合（混合）飼料或單一飼料，按四分法縮分制備實驗室樣品，取10～20g粉碎，使其全部通過樣品篩（6.2）。充分混勻，裝入密閉容器。
8 分析步驟
8.1 A法
8.1.1 總賴氨酸
8.1.1.1 酸水解
稱取約含50mg粗蛋白質的樣品兩份，置于500mL燒瓶（6.5）中，加入250mL鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器，置120～130℃油浴（6.4）中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。必要時將酸解液（連同水解后不溶物）重新定容至250mL。過濾，吸取5mL濾液，于旋轉蒸發器（6.7）上，60℃左右蒸發至干。加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于5mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），離心10min（4000r/min），取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.1.2 測定
打開氨基酸自動分析儀（6.8），使柱溫，反應浴溫度，緩沖液及茚三酮流速等各種操作參數達到預定要求，并按儀器說明書取一定量的賴氨酸標準液（5.9）進行校準。然后在同樣條件下取8.1.1.1中所得之樣品溶液進行測定。
8.1.2 非有效賴氨酸
8.1.2.1 二硝基苯化反應
稱取約含50mg粗蛋白的樣品兩份，置于150mL燒瓶（6.5）中，加入4mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min，其間需不時振搖。再加入6mLDNFB乙醇溶液（5.3），加蓋，振搖，注意勿使樣品顆粒粘附于瓶壁上。在室溫下暗處放置過夜。
8.1.2.2 純化
在旋轉蒸發器上，溫度不高于40℃條件下，將上述反應物蒸干，加入35mL乙醚（5.1），振搖或攪拌后，待固體充分沉降，棄去絕大部分乙醚，小心不要帶出固體樣品顆粒。重復上述操作兩次，每次加25mL乙醚（此步驟乙醚層有時似較渾濁，只要傾倒時不帶出樣口顆粒，可不必離心）。最后，蒸發除去殘存乙醚。
8.1.2.3 酸水解
邊沖洗瓶口瓶壁邊加入75mL鹽酸（5.4），使樣品全部浸于酸中，裝好回流冷凝器，置于120～130℃油浴中，使其徐徐沸騰，回流水解24h。
取下燒瓶，冷卻。將水解物定量轉移至100mL容量瓶中，用水定容，過濾。吸取5mL濾液于旋轉蒸發器上，60℃左右蒸發至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
將殘渣溶于3mL稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），用離心機（6.6）離心10min，取上清液上機或貯于具塞小管中冷藏備用。
8.1.2.4 測定
同8.1.1.2。
非有效賴氨酸峰值較低，易受鄰峰或雜峰干擾，如某些氨基酸自動分析儀該峰分離不好，需將樹脂床（或分析柱）加長，或變換參數與程序。
8.2 B法──簡化法
8.2.1 總賴氨酸
準確稱取約含50mg粗蛋白質的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入25mL 鹽酸（5.4），裝好回流冷凝器并置于預先熱至120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，緩緩煮沸水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液2mL，于旋轉蒸發器，60℃濃縮至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6），（粗蛋白質含量為10％～20％的樣品加2mL，粗蛋白質含量為30％～50％的加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
8.2.2 非有效賴氨酸
8.2.2.1 二硝基苯化反應
稱取約含蛋白質20～25mg的樣品雙份，置于50mL水解管中，加入2mL碳酸氫鈉溶液（5.2），放置10min（其間不時振搖），加入DNFB乙醇溶液（5.3）3mL，振搖混勻后，在室溫下暗處放置過夜。
將上述水解管置85～90℃水浴中蒸去乙醇，直至振搖時不產生泡沫為止。此時水解管內物應失重2.5～3g。
8.2.2.2 純化
于去醇后的水解管內加入2mL乙醚（5.1），加塞，劇烈振搖后令其分層，棄去乙醚層，再用乙醚萃取兩次，每次10mL，棄去醚層后，將水解管放入60～70℃水浴，除去殘存乙醚。
8.2.2.3 酸水解
邊沖洗管口管壁邊加入23mL鹽酸（5.5）裝好冷凝器，與測總賴氨酸樣品一道置120～130℃金屬塊消煮爐（6.10）上，回流水解24h。
冷卻，將水解液定容至50mL，混勻，過濾。吸取濾液5mL于60℃旋轉蒸發器上蒸發至干，加水少許，重復蒸干1～2次。
殘渣中加入適量稀釋用檸檬酸鈉緩沖液（5.6）（蛋白質含量10％～20％加3mL，30％～50％加5mL），充分溶解后離心，取上清液上機。
9 分析結果的表述
9.1 總賴氨酸
樣品中總賴氨酸含量W1，以其質量百分率表示，即：
………………………………（1）
式中：A── 每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m1── 樣品質量，mg；
D── 稀釋倍數。
9.2 非有效賴氨酸
樣品中非有效賴氨酸含量W2，以其質量百分率表示，即：
………………………………（2）
式中：A── 每毫升上機液中賴氨酸含量，ng；
m2── 非有效賴氨酸測定中樣品質量，mg；
D── 稀釋倍數。
9.3 有效賴氨酸
樣品中有效賴氨酸含量W3，以質量百分率表示，即：
有效賴氨酸W3＝W1－W2……………………………………（3）
若有效賴氨酸含量以其在總賴氨酸中的質量百分率表示，則
W3（％）＝〔（W1－W2）/W1〕×100……………………（4）
10 重復性
同一試樣兩平行測定值的相對相差，應不超過其平均值的10％。
注：與生物測定法相比，本法測定結果偏高，在分析評價實驗結果時需加以注意。
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