摘要：一般來(lái)講，單胃動(dòng)物機(jī)體在發(fā)生炎癥時(shí)對(duì)含硫氨基酸的需求有進(jìn)一步增加的跡象，這是因?yàn)?/span>含硫氨基酸可利用其所帶的甲基，對(duì)有毒物或藥物進(jìn)行甲基化而起到解毒的作用，因此對(duì)單胃動(dòng)物追加蛋氨酸可緩解機(jī)體負(fù)氮平衡。本文從反芻動(dòng)物著手，選取

20頭安格斯雜交肉牛用來(lái)評(píng)估日糧中添加革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)和蛋氨酸對(duì)其氮平衡、血清激素、血清蛋白、血清尿氮和血清氨基酸的影響。其中沒(méi)有添加革蘭氏陰性菌脂多糖的組用(−LPS)表示，低劑量的用(+LPS)表示；沒(méi)有添加蛋氨酸的用(−MET)表示，（+MET）表示添加了14 g/d的瘤胃保護(hù)性蛋氨酸。當(dāng)肉牛適應(yīng)了粗飼料（DM=1.4%/單位體重）后的14d對(duì)其添加MET，然后在飼喂MET后的第1d和第3d分別對(duì)肉牛注射2 μg/單位體重和1 μg/單位體重的LPS。在飼喂LPS前采集肉牛血液樣本，之后在飼喂LPS的2, 4, 6,8, 10, 12和 24 h后分別采集其血液樣本。飼喂5d內(nèi)收集未被采食的飼料和糞便以及尿液等樣本。結(jié)果顯示，+LPS組較−LPS組的肉牛直腸溫度和血清皮質(zhì)醇濃度、血清激素、血清蛋白、腫瘤壞死因子-α都有所增加，T4（四碘甲狀腺原氨酸）和T3（三碘甲狀腺原氨酸）有所下降（P < 0.01)。+LPS組的血漿尿氮含量和−LPS組有顯著差異（P = 0.03)。在LPS或者 Met組中血清IGF結(jié)合蛋白質(zhì)類的含量差異不顯著(P ≥ 0.26)。+LPS組中血漿中Thr, Lys, Leu, Ile, Phe, Trp, Asn, Glu, Orn等氨基酸的含量較−LPS組有所下降，血漿中的Ala有所增加，Gly和Ser含量在初始時(shí)有所增加，之后有所下降（+LPS：-LPS，LPS × h; P ≤ 0.04）。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的干物質(zhì)采食量（DMI）變化不是很明顯，但+LPS組較−LPS的DM消化率有所減少(P = 0.04)。各處理組的氮采食量、糞氮排泄量和氮消化差異不顯著(P ≥ 0.24)，但+LPS組的尿氮排泄量(P < 0.01)有所增加，尿氮保留有所減少(P< 0.01)。另外從LPS × Met的互作效應(yīng)來(lái)看，當(dāng)給肉牛注射LPS時(shí)，在對(duì)其追加蛋氨酸不能提高生長(zhǎng)育肥牛氮的利用率，+LPS組肉牛血漿中必需氨基酸的下降說(shuō)明當(dāng)肉牛機(jī)體在應(yīng)對(duì)某種毒素時(shí)，其作為免疫應(yīng)答對(duì)這些氨基酸的需求有所增加。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物日糧和分組

選取初始體重為262 ± 6.3 kg的雜交安格斯肉牛20頭，牛棚地面鋪2.54cm的橡膠，可以用自來(lái)水自動(dòng)沖洗。所有的肉牛在上午7:00和晚上19:00飼喂1.4%單位體重（以DM為基礎(chǔ)）的粗日糧（表1），自由飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間持續(xù)19d，在飼喂粗飼料的14d內(nèi)所有的肉牛基本適應(yīng)了該種日糧。其余的5d為收集樣品期。其中沒(méi)有添加革蘭氏陰性菌脂多糖的組用(−LPS)表示，低劑量的用(+LPS)表示（Steiger 等, 1999)；沒(méi)有添加蛋氨酸的用(−MET)表示，（+MET）表示添加了14 g/d的過(guò)瘤胃保護(hù)性蛋氨酸。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)肉牛添加14 g/d 的MET（DL-蛋氨酸含量≥70%，過(guò)瘤胃保護(hù)性蛋氨酸≥90%），該MET每天的瘤胃最小吸收量為7.9g，其中MET早、晚7點(diǎn)各飼喂7g。在飼喂MET的第1d后，也就是在整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行的第15d，在肉牛飼喂3h后對(duì)其注射2 μg/單位體重的LPS，注射速度為1mL/min（LPS溶于無(wú)菌鹽水中）。該步驟在飼喂MET的第3d后，也就是在整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行的第15d重復(fù)一次，不過(guò)LPS的注射劑量減半（1 μg/單位體重）。對(duì)于−LPS組的肉牛，將對(duì)此注射同等劑量的無(wú)菌鹽水作為對(duì)照組。

表1 粗日糧成分和營(yíng)養(yǎng)水平

注：1）ME, Mcal/kg = (4.103 - 0.0446 × %ADF) × 0.82 (Harlan 等,1991)。

2）NE_m, Mcal/kg = 1.37 × ME - 0.138 × ME² + 0.0105 × ME³ -1.12 (NRC, 2000).

3）NE_g, Mcal/kg = 1.42 × ME - 0.174 × ME² + 0.0122 × ME³ - 1.65(NRC, 2000).

1.2 樣本收集

飼喂MET和注射LPS后的5d內(nèi)，每24h一次收集肉牛的糞便，然后將其冷凍備用。收集試驗(yàn)第14-18d的未被采食的日糧以及第15-19d的動(dòng)物糞尿，其中尿液用裝有600ml 3 M HCl溶液的20L的真空袋通過(guò)輸尿管取得（HCI主要是為了降低氨氣濃度）。將所有的糞和尿稱重，然后取10%的糞樣本和1%的尿液冷藏。

在注射LPS的當(dāng)天，測(cè)量牛直腸溫度（從注射前開(kāi)始測(cè)定，每隔2h測(cè)定一次，一直持續(xù)到注射后的12h），同樣的從注射LPS前開(kāi)始取肉牛靜脈血±8 mL，之后在注射后的第 2, 4, 6, 8, 10, 12和 24 h后各取一次。血液在室溫下靜置30分鐘，然后分離血清，之后將上層血清置于10°C的冷凍離心機(jī)（1,500 × g）中離心20分鐘，將離心后的血清和血漿樣本迅速冷藏備用。

圖1 +LPS組和-LPS組肉牛直腸溫度對(duì)比

1.3樣本數(shù)據(jù)測(cè)定

日糧、未被采食的日糧和糞便樣本在55°C的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，然后在2-mm目下過(guò)濾，將過(guò)濾后的底層樣本在105°C對(duì)流烤箱中烘烤24h以用來(lái)測(cè)定DM值。樣本中的N含量用N的燃燒值來(lái)計(jì)算。用比色法測(cè)定血液和尿液中的尿素氮含量（飼喂LPS的第0, 2, 4, 6, 8, 10和12h）。取4 μL的血漿（尿液）加入200μL的脲酶反應(yīng)劑混合均勻（振蕩器混合15s），然后置于37°C反應(yīng)5分鐘，之后用全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀（340 nm）讀取數(shù)據(jù)。測(cè)定血清皮質(zhì)醇、血清三碘甲狀腺原氨酸（T3），血清甲狀腺素（T4），腫瘤壞死因子-α（TNFα）和IGF-1。

2 結(jié)果

LPS組肉牛的直腸溫度、血清TNFα, T4, T3, 血清皮質(zhì)醇、血清促乳激素和血清蛋白值在不同的飼喂時(shí)間上差異顯著(P < 0.01，圖1)，+LPS組的肉牛在注射LPS后的0-2h的直腸溫度要比-LPS組的高，且在注射LPS后的2-8h直腸溫度一直較-LPS組的低，在注射LPS 10-12h+LPS組的肉牛直腸溫度開(kāi)始降低，且該時(shí)間段兩組肉牛的直腸溫度沒(méi)有顯著差異。+LPS組的2h血清皮質(zhì)醇較-LPS組有所增加（圖2），且在整個(gè)樣本采集期，+LPS組的血清皮質(zhì)醇含量一直比-LPS組高。+LPS組的血清催乳激素（圖2）和TNFα（圖3）在注射LPS后有極大的增加，2h后開(kāi)始有所下降，6h后兩組沒(méi)有顯著差異。在整個(gè)樣本收集器，+LPS組的甲狀腺素（T3 和 T4，圖4）一直比-LPS組的低。+LPS組 和 −LPS組的肉牛血清蛋白在0-10h之間沒(méi)有顯著差異，12h后，+LPS組的血清蛋白較−LPS組的有較大幅度大提高（圖5）。在肉牛日糧中添加LPS或者Met對(duì)肉牛血清中IGF-1的含量沒(méi)有太大的影響(P ≥ 0.26，表2)，+LPS組的血清尿素氮比−LPS組的的要高(P = 0.03).

圖6為LPS × Met × h互作對(duì)血漿蛋氨酸含量的影響圖。數(shù)據(jù)顯示，在注射LPS前，+MET組 比 −MET組的血漿蛋氨酸含量要高，但注射LPS后，+MET組的血漿蛋氨酸含量開(kāi)始下降，當(dāng)注射LPS4-12h后，兩組的血漿蛋氨酸含量基本持平。

表2各處理組肉牛的血漿中尿氮、IGF-1和His, Val, Cys, Asp, Gln和 Tyr 含量對(duì)比表

LPS組中血清中的氨基酸含量如Thr, Lys, Leu, Ile, Phe, Trp,Ser, Gly, Ala, Asn, Glu, 和 Orn在不同的時(shí)間段其含量不同(P < 0.01)。在注射LPS 2h后，+LPS 組的血清Thr含量要比−LPS組的高（圖7）,4h后+LPS 組的血清Thr 要比−LPS組的低（P < 0.01）。在注射LPS 2h后，+LPS 組的血清Lys含量要比−LPS組的高（P< 0.01）,4h后兩組血清中Lys的含量沒(méi)有太大差異（圖7)。注射LPS后的2-12h內(nèi)，+LPS 組的血清Leu, Ile, Phe 和Trp含量要比−LPS組的低（6h血清Leu含量除外，圖7）。在注射LPS 2h內(nèi)，+LPS 組的血清Gly 和 Ser含量比−LPS組要高，但2-4h后+LPS 組該含量開(kāi)始下降，且該趨勢(shì)一直延續(xù)到6-12 h(圖8; P < 0.01)。在注射LPS 2h時(shí)，+LPS 組的血清Ala含量比−LPS組明顯增加，且+LPS 組6h血清Ala含量也要明顯高于−LPS組，相對(duì)而言，+LPS 組的第4, 10, 和 12 h的血清Ala含量比−LPS組增幅有所緩和（圖8）。在整個(gè)采集期+LPS 組的血清Asn含量都比−LPS組要低（圖8， P < 0.01）。+LPS 組的血清Glu含量在初始時(shí)比−LPS組要到，從2-4h后開(kāi)始下降，且4h后兩組的

Glu含量差異不顯著(圖8; P = 0.02)。兩組血清Orn含量和Glu含量走勢(shì)基本類似（圖8）。

表2的數(shù)據(jù)顯示，+LPS 組的血清Tyr含量都比−LPS組要低(P < 0.01)，且+Met組的血清Val含量也要比-Met組的低(P = 0.02)。血清中其他的氨基酸如His, Cys, Gln, 和 Asp在各處理組中的差異不顯著。

    關(guān)于LPS × Met的互作效應(yīng)，各處理組的DM 和 N采食量, 糞和尿氮排泄沒(méi)有顯著差異(表 3)。另外+LPS 組的肉牛DM消化量(P = 0.04)和干物質(zhì)采食量DMI(P= 0.13)較−LPS組的要低。各處理組的肉牛的N采食量(P = 0.37)、糞氮排泄量(P = 0.82)和N消化(P = 0.24)沒(méi)有顯著差異，但+LPS 組的肉牛的尿氮排泄量要比−LPS組要高(P = 0.01)，且尿氮存留量要低(P < 0.01)。數(shù)據(jù)顯示，對(duì)肉牛追加Met不能影響其氮采食量(P = 0.86)、尿氮的排泄(P 0.88)、氮消化率(P = 0.56)和氮保留(P = 0.61)，但卻增加了糞氮的排泄量(P = 0.03)

表3 各處理組肉牛的采食量、氮消化率和氮平衡對(duì)比

3 討論

3.1 LPS的注射對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)給肉牛注射LPS時(shí)可提高其血清皮質(zhì)醇、催乳激素、TNFα、血清蛋白、直腸溫度和降低血清甲狀腺素，這說(shuō)明LPS可使得肉牛肝臟蛋白酶活性增強(qiáng)，在一定程度上激活其化學(xué)反應(yīng)。Steiger 等(1999) 和 Waldron等 (2003)通過(guò)對(duì)肉牛注射LPS后進(jìn)行研究分析，也得出了同樣的結(jié)論。盡管傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為催乳激素是為促進(jìn)乳腺發(fā)育生長(zhǎng)，引起并維持泌乳的，但該激素還可刺激淋巴細(xì)胞的增值，從而是免疫反應(yīng)不可缺少的重要組成成分(Arkins等, 1993)。LPS可活化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血清皮質(zhì)細(xì)胞來(lái)改變血清中的皮質(zhì)醇、催乳激素、TNFα的含量(Tizard,2004), 能夠活化單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),促進(jìn)細(xì)胞因子釋放,促進(jìn)補(bǔ)體的活化和抗體的產(chǎn)生,對(duì)特異性免疫反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。

人體血清中存在兩種主要的甲狀腺激素，即T4（四碘甲狀腺原氨酸）和T3（三碘甲狀腺原氨酸）。T4和T3在血液中大部分與血漿中的甲狀腺素結(jié)合球蛋白（TBG）相結(jié)合。當(dāng)體內(nèi)甲狀腺功能異常時(shí)，T4和T3值也會(huì)發(fā)生異常。注射LPS后，肉牛血清中的T3 和 T4含量明顯下降,因?yàn)?span lang="EN-US">LPS可引起肝臟產(chǎn)5′-脫碘酶的減少，而5′-脫碘酶主要存在于肝、腎組織中,能催化T4轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚詮?qiáng)的T3，而LPS通過(guò)減少5′-脫碘酶來(lái)降低T4向T3的轉(zhuǎn)化速率。(Kahl 等, 2000)。 Cole等 (1994)指出降低血漿中T3濃度的可增加引起牛傳染性鼻竇炎的發(fā)生機(jī)率。之前的研究表明，當(dāng)給不同動(dòng)物注射LPS后，其血清中IGF-1的含量有所下降(牛，Elsasser 等, 綿羊，Briard 等, 2000；大鼠，Soto et al., 1998))。 

       肉牛注射LPS后，其血清中Met, Lys, Leu,Ile, Phe, Trp, Gly, Ser, Asn, Glu和Orn 等氨基酸有所下降，這可能和這些氨基酸參與免疫反應(yīng)有關(guān)。通常在動(dòng)物體內(nèi)存在某種毒素時(shí)，機(jī)體對(duì)氨基酸的需求進(jìn)一步增加。目前有關(guān)氨基酸對(duì)免疫反應(yīng)的影響報(bào)道較少，由于賴氨酸、蛋氨酸和蘇氨酸是豬和家禽大多數(shù)日糧中的限制件氨基酸，因而研究它們對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的影響具有重要意義。在人類急性炎癥期，機(jī)體對(duì)Phe, Trp, Lys, Cys和 Ser等氨基酸的需求有增加的趨勢(shì)(Reeds和Jahoor, 2001)，且人淋巴細(xì)胞在酶的作用下會(huì)優(yōu)先選擇支鏈氨基酸以滿足蛋白和能量需要(Calder, 2006)。

       在注射LPS后血漿蛋氨酸含量明顯下降，這可能說(shuō)明LPS可增強(qiáng)蛋氨酸的轉(zhuǎn)硫作用，這是因?yàn)樵跈C(jī)體存在毒素的情況下，其代謝對(duì)Cys 和S -腺苷甲硫氨酸的需求有所增加的緣故(Li 等, 2007)。Malmezat等 (2000)指出，在體內(nèi)存在毒素時(shí)，Met向Cys的轉(zhuǎn)硫作用將增加80%。LPS的添加可能會(huì)降低瘤胃運(yùn)動(dòng)速度，從而導(dǎo)致其DMI采食量的下降；+LPS 組的肉牛相對(duì)−LPS組其DM消化率有所下降，這可能是LPS可降低瘤胃PH所引起的。

     +LPS 組的肉牛尿氮排泄量和尿氮保留分別比-LPS 組要增加55%和降低145%，這說(shuō)明LPS對(duì)氮平衡產(chǎn)生了負(fù)面影響。Cole 等(1986)和Orr 等(1988)研究指出，當(dāng)給機(jī)體接種IBRV可使尿液中氮存留有所減少，氮排泄有所增加。

3.2蛋氨酸添加對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

在注射LPS前，+Met組的血漿蛋氨酸含量較-Met組的要高，這是由瘤胃對(duì)過(guò)瘤胃保護(hù)性蛋氨酸的吸收有所增加所致。當(dāng)給肉牛注射LPS后，其血清蛋氨酸含量開(kāi)始有所下降，這說(shuō)明當(dāng)體內(nèi)存在毒素時(shí)，蛋氨酸為免疫系統(tǒng)或肝臟解毒代謝所利用。當(dāng)給肉牛注射LPS時(shí)，+Met組和-Met組在牛的氮保留上沒(méi)有顯著差異，這可能和蛋氨酸不是肉牛的第一限制性氨基酸有關(guān)。

 4 結(jié)論

總的來(lái)看，當(dāng)生長(zhǎng)育肥牛體內(nèi)存在LPS時(shí)，對(duì)其追加蛋氨酸不能緩解LPS對(duì)肉牛代謝的影響，也不能增加氮的利用率，另外當(dāng)體內(nèi)存在毒素（LPS）時(shí)，機(jī)體免疫代謝對(duì)氨基酸的需求有所增加，這也是導(dǎo)致生長(zhǎng)育肥牛血清中Met,Lys, Leu, Ile, Phe, Trp, Gly, Ser和Asn等氨基酸含量有所下降的最直接的原因。