豬肝中克倫特羅檢測方法—酶聯(lián)免疫吸附測定法
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬肝中克倫特羅檢驗(yàn)的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肝中克倫特羅的殘留常規(guī)快速篩選及定量檢測。
2 測定方法
2.1 原理與方法
測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板包被有克倫特羅特異性抗體的抗體，加入抗克倫特羅的特異性抗體，兩者結(jié)合被固定。標(biāo)樣或試樣中克倫特羅與酶（辣根過氧化物酶）標(biāo)記抗原競爭抗克倫特羅的特異性抗體。通過洗滌以除去沒有與抗克倫特羅的特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入酶基質(zhì)（過氧化尿素）的發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）結(jié)合到酶聯(lián)板上的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測定吸光度值。吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比。
2.2 試劑、用途及儀器、設(shè)備
需自備的試劑、設(shè)備：
2.2.1 50mmol/L鹽酸
2.2.2 1 mol/L氫氧化鈉
2.2.3 50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液PH3.0
2.2.4 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液PH3.0
2.2.5 甲醇：分析純
2.2.6 分析天平
2.2.7 勻漿機(jī)
2.2.8 固相萃取裝置
2.2.9 微孔板酶標(biāo)儀（450nm）
2.2.10 離心機(jī)
2.2.11 微型振蕩器
2.2.12 微量加樣器（20μl，50μl，100μl，200μl，250μl）
2.2.13 C18柱
競爭酶標(biāo)免疫法試劑盒可用于定量測定尿、肌肉、肝臟等中的克倫特羅。試劑盒中包括了預(yù)處理完成后檢測用的試劑：
2.2.14 克倫物羅系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0ng/L，100ng/L，，300ng/L，900ng/L，2700ng/L，8100ng/L）
2.2.15 酶標(biāo)板
2.2.16 抗克倫特羅的特異性抗體
2.2.17 酶標(biāo)記抗原
2.2.18 緩沖溶液
2.2.19 酶基質(zhì)/發(fā)色劑
2.2.20 反應(yīng)停止液（1mol/L硫酸）
3 制樣
3.1 樣品的制備
3.1.1 將豬肝樣品解凍，剪碎置于勻漿機(jī)中高速搗碎，取5g勻漿的豬肝樣品與25ml l50mmol/L鹽酸混合，振蕩1.5h均質(zhì)。
3.1.2 稱6g 均質(zhì)物（相當(dāng)于1g肝臟），加入離心瓶中，在10℃-15℃，至少4000g離心15min。
3.1.3 轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心瓶中，加300μl
1mol/LNaOH[3.2.2]混合15min，加入4ml500mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液PH3.0[3.2.4]，簡單地混合，并在4℃保存至少1.5h或過夜。
3.1.4
再在10℃—15℃，至少4000g離心15min，分離全部上清液（應(yīng)該是清亮的，非常重要），使其升至室溫（20℃—24℃），然后用C18柱純化。
3.2 C18柱純化步驟
所有試劑和樣品提取液在過柱純化前應(yīng)達(dá)到室溫（20℃-24℃），純化過程中嚴(yán)格控制過柱時(shí)的流速。
3.2.1 用3ml甲醇[3.2.5]洗滌柱子，流速為每秒1滴。
3.2.2 用2ml洗滌液[3.2.3]洗滌柱子
3.2.3 樣品進(jìn)柱（分離的全部上清液）
3.2.4 用2ml洗滌液[3.2.3]洗滌柱子。
3.2.5 用正壓去除殘留的流體并且用空氣或氮?dú)獯?min干燥柱子。
3.2.6 用1ml甲醇[3.2.5]洗脫樣品，流速為每分鐘15滴。
3.2.7 50℃-60℃下用弱空氣或氮?dú)饬鲗⑾疵撘和耆舾伞?p> 3.2.8 用1ml雙蒸水溶解干燥的殘留物，取20μl進(jìn)行分析。
3.3 樣品的保存
3.3.1 未處理的樣品冷凍保存。
3.3.2 鹽酸均質(zhì)后的樣品2℃—8℃可保存3天。
3.3.3 以磷酸二氫鉀緩沖液提取后的樣品（C18柱純化之前）2℃—8℃可保存2天，使用前離心。
3.3.4 C18柱純化步驟（即4.2.6）所獲得的甲醇洗脫物冷凍可以保存數(shù)周，2℃—8℃可保存2周。
3.3.5 用雙蒸水溶解的干燥殘留物(即4.2.8)2℃-8℃可保存1周。
3.4 測定
測定之前將所有試劑回升至室溫20℃-24℃，供試樣品取其上清液。
3.4.1 測定程序（室溫20℃-24℃條件下操作）
（1）將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。
（2）加入100μl稀釋后的抗體溶液到每一個(gè)微孔中底部，在室溫孵育15min。
（3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，用250μl蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，重復(fù)操作兩遍以上。
（４）精密吸取２０μl標(biāo)準(zhǔn)溶液［3.2.14］及處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
（5）加入100μl稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部，在微型震蕩器上混勻，室溫孵育30min。
（6）重復(fù)步驟（3）
（7）加入100μl基質(zhì)/發(fā)色試到微孔中，在微量振蕩器上充分混勻（或小心地在平面上轉(zhuǎn)動(dòng)酶標(biāo)板以充分混合），并在室溫暗處孵育15min。
（8）加入100μl反應(yīng)停止液到微孔中，混勻。在60min內(nèi)450nm處以空氣為空白測定吸光度值。
3.4.2 結(jié)果判定和表述
按下式計(jì)算百分吸光度值：
百分吸光度值=B/B0×100%
式中：B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；
B0—為零標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值；
以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液中克倫特羅濃度（ng/L）的自然對(duì)數(shù)，Y軸為百分吸光度值，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出供試樣品中克倫特羅的濃度（ng/L）。也可以用專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件求出供試樣品中克倫特羅的濃度。
檢測結(jié)果小于1000ng/kg時(shí)判為未檢出，大于或等于1000ng/kg時(shí)判為可疑，需要復(fù)檢后再確定。復(fù)檢后小于或等于1000ng/kg為未檢出，大于1000ng/kg為陽性。豬肝稀釋系數(shù)為1。
江西省地方標(biāo)準(zhǔn)
DB36/T410-2003
豬尿中克倫特羅檢測方法—酶聯(lián)免疫吸附測定法
前言
克倫特羅為β—腎上腺素受體激動(dòng)藥，是一種用于人治療哮喘、支氣管痙攣的藥物。研究發(fā)現(xiàn)在飼料中添加克倫特羅可促進(jìn)動(dòng)物生長、提高瘦肉率，特別是改進(jìn)脂肪型動(dòng)物的肉與脂肪的比例，豬飼用后生長速度快，體型好，且瘦肉多、脂肪少，被當(dāng)作“瘦肉精”而成為一些飼料生產(chǎn)企業(yè)和養(yǎng)豬戶的“秘密武器”。但是克倫特羅進(jìn)入豬體內(nèi)后，主要分布在肝等內(nèi)臟器官，在體內(nèi)代謝的時(shí)間較長，容易造成藥物在組織中殘留，給消費(fèi)者帶來危害；健康的人在食用一定量的殘留有克倫特羅的豬肉或內(nèi)臟后，可能出現(xiàn)肌肉震顫、心慌、戰(zhàn)栗、惡心、代謝紊亂、呼吸急促、煩躁不安等癥狀。由于克倫特羅的性質(zhì)穩(wěn)定，能夠在豬尿中以原形排出，因此制訂豬尿中克倫特羅的檢測方法，以監(jiān)測“瘦肉精”的使用，顯得非常重要。
競爭酶標(biāo)免疫法是非常有效的篩選方法，可定量測定尿、肌肉、肝臟及牛眼中的克倫特羅。此法快速簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，較易掌握推廣。
本標(biāo)準(zhǔn)由江西省農(nóng)業(yè)廳提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所負(fù)責(zé)起草。
本標(biāo)準(zhǔn)起草人：劉安南、陳文云、萬文根、徐國茂。
豬尿中克倫特羅檢測方法—酶聯(lián)免疫吸附測定法
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬尿中克倫特羅檢驗(yàn)的制樣和酶聯(lián)免疫吸附測定方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬尿中克倫特羅的殘留常規(guī)快速篩選及定量檢測。
2 測定方法
2.1 原理與方法
測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板包被有克倫特羅特異性抗體的抗體，加入抗克倫特羅的特異性抗體，兩者結(jié)合被固定。標(biāo)樣或試樣中克倫特羅與酶（辣根過氧化酶）標(biāo)記抗原競爭抗克倫特羅的特異性抗體。通過洗滌以除去沒有與抗克倫特羅的特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)記抗原。加入酶基質(zhì)（過氧化尿素）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）結(jié)合到酶聯(lián)板上的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在450nm處測定吸光度值。吸光度值與樣品中的克倫特羅濃度成反比。
2.2 試劑、用途及儀器、設(shè)備
競爭酶標(biāo)免疫法試劑盒可用于定量測定尿、肌肉、肝臟等中的克倫特羅。試劑盒中包括了所有檢測用的試劑，在使用前，請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀試劑盒說明書。定量分析須用微孔板酶標(biāo)儀（450nm）進(jìn)行測量。
2.2.1 克倫特羅系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0ng/L，100 ng/L，300 ng/L，900 ng/L，2700 ng/L，8100 ng/L）
2.2.2 酶標(biāo)板
2.2.3 抗克倫特羅的特異性抗體
2.2.4 酶標(biāo)記抗原
2.2.5 緩沖溶液
2.2.6 酶基質(zhì)/發(fā)色劑
2.2.7 反應(yīng)停止液（1mol/LH2SO4）
2.2.8 微孔板酶標(biāo)儀（450nm）
2.2.9離心機(jī)
2.2.10微型振蕩器
2.2.11 微量加樣器（20μl，50μl，100μl，200μl，250μl）
3 制樣
3.1 樣品的制備
取適量新鮮或冷凍空白或供試尿液，如尿樣渾濁，則必須2000g離心10min，取上清液留用。
3.2 樣品的保存
-20℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?p> 3.3 測定
測定之前將所有試劑回升至室溫20℃—24℃，取解凍后的供試樣品，2000g離心10min，取上清液，作為供試液。
3.3.1 測定程序（室溫20℃—24℃條件下操作）
（1）將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。
（2）加入100μl稀釋后的抗體溶液到每一個(gè)微孔中底部，在室溫孵育15min。
（3）倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打（每行拍打3次），以保證完全除去孔中的液體，用250μl蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中液體，重復(fù)操作兩遍以上。
（４）精密吸取２０μl標(biāo)準(zhǔn)溶液及處理好的樣品到各自的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
（5）加入100μl稀釋的酶標(biāo)記物到微孔底部，在微型震蕩器上混勻，室溫孵育30min。
（6）重復(fù)步驟（3）。
（7）加入100μl基質(zhì)/發(fā)色劑到微孔中，在微量振蕩器上充分混勻（或小心地在平面上轉(zhuǎn)動(dòng)酶標(biāo)板以充分混合），并在室溫暗處孵育15min。
（8）加入100μl反應(yīng)停止液到微孔中，混勻。在60min內(nèi)450nm處以空氣為空白測定吸光度值。
3.3.2 結(jié)果判定和表述
按下式計(jì)算百分吸光度值：
百分吸光度值=B/B0×100%
式中：B—為標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試樣品的平均吸光度值；
B0—為零標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液平均吸光度值；
以X軸為標(biāo)準(zhǔn)溶液中克倫特羅濃度（ng/L）的自然對(duì)數(shù)，Y軸為百分吸光度值，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出供試樣品中克倫特羅的濃度（ng/L）。也可以用專業(yè)計(jì)算機(jī)軟件求出供試樣品中克倫特羅的濃度。
檢測結(jié)果小于1000ng/L時(shí)判為未檢出，大于或等于1000ng/Lg時(shí)判為可疑，需要復(fù)檢后再確定。復(fù)檢后小于或等于1000ng/L為未檢出，大于1000ng/L為陽性。尿液稀釋系數(shù)為1。
