1 范圍
    本標準規(guī)定了可食性動物組織中鹽酸克侖特羅殘留量的測定方法。
    本標準適用于可食性動物組織中鹽酸克侖特羅殘留量的測定。

    第一篇  高效液相色譜法

    2 原理
    樣品經有機溶機（甲苯+二氯甲烷混合液）抽提，提取液經酸性氧化鋁小樁凈化，洗脫液濃縮后用0.1mol/L鹽酸溶解后供高效液相色譜儀進行檢測。
   
    3 試劑
    除方法另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為二次重蒸水或超純水。
    3.1 酸性氧化鋁（100-200目），層析用。
    3.2 甲苯
    3.3 二氯甲烷
    3.4 乙腈，色譜純
    3.5 鹽酸
    3.6 氫氧化鈉
    3.7 磷酸二氧鉀
    3.8 乙二胺四乙酸二鈉
    3.9 鹽酸克侖特羅貯備液：精密稱取鹽酸克侖特羅標準品，用0.1mol/L鹽酸溶液配成100μg/ml，存放在冰箱中備用。

    4 儀器
    4.1 高效液相色譜儀，配有紫外檢測器。
    4.2 旋轉蒸發(fā)器
    4.3 勻漿機
    4.4 超聲波發(fā)生器

    5 操作方法
    5.1 提取
    提取動物肝臟樣品10.0g，加入0.1mol/L鹽酸溶液25ml(乙酸乙酯飽和)勻漿1分鐘（2000rpm），超聲5分鐘，離心5分鐘（400rpm），取上清液用40％NaOH溶液調節(jié)至pH12。加甲苯-二氧甲烷（3：1V/V）三次萃?。看?0ml），合并提取液。
    5.2 凈化
    將提取液蒸發(fā)至約5ml，過酸性氧化鋁小柱（直徑1cm，長12cm），用0.1mol/L鹽酸溶液洗脫待測成份，蒸干后用0.1mol/L鹽酸溶液0.5ml溶解，0.45μm濾膜過濾后供高效液相色譜儀檢測。
    5.3 色譜條件
    5.3.1 色譜柱，C18柱。
    5.3.2 流動相：乙腈：緩沖液[20mmol/L磷酸二氫鉀+30μmol/L EDTA，Pμ3.9]（20：80V/V）
    5.3.3 流速：1ml/min。
    5.3.4 柱溫：30℃。
    5.3.5 檢測波長：243nm。
    5.3.6 進樣量：20μl。
    5.4 測定
    根據樣品液中鹽配克侖特羅含量情況，選定峰面積相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣品溶液中鹽酸克侖特羅響應值均應在儀器檢測線性范圍內。對標準工作溶液和樣品液等體系參插進樣測定。
    5.5 計算
                   X=A×Cs×V÷(As×m)
式中：X—試樣中克侖特羅含量，mg/kg；
      A—液中鹽酸克侖特羅的峰面積，μV.S；
      As—標準工作液中鹽酸克侖特羅的峰面積：μV.S；
      Cs—標準工作液中鹽酸克侖特羅的濃度，μg/mL；
      V—樣液量終定溶體積，mL；
      m—最終樣液所代表的試樣量，g。
注：計算結果需將空白值扣除。±20％

    6 精密度和靈敏度   
    在上述色譜條件下，本方法的檢測限為0.002μg/g，回收率為80％±20％。

    第二篇  氣相色譜—質譜聯用法

    7 原理
    樣品用β—鹽酸葡萄糧醛甙酶或芳基硫酸酯酶，在pH5.2的緩沖溶液中消化。萃取的組織樣液通過離心和過濾分離。萃取液用C18和SCX小柱，固相萃取凈化，分離的藥物殘留經過雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生后用帶有質量選擇檢測器的氣相色譜儀測定。

    8 試劑
    8.1 乙酸銨緩沖液（20mmol/L，pH5.2）、溶解1.45g乙酸銨于500ml-700水中，用乙酸調整pH值至5.2并稀釋到1升。
    8.2 β—鹽酸葡萄糧醛甙酶芳或基硫酸酯酶溶液30U/ml或相當者。
    8.3 30mmol/L鹽酸：30mL 1mo/L鹽酸稀釋到1升蒸餾水中。
    8.4 甲醇：分析純。
    8.5 4％氨化甲醇（amonium methanol）：用甲醇稀釋4ml氨溶液（比重0.88）至100ml。
    8.6 雙三甲基硅基三氟乙酰胺，BSTFA。
    8.7 甲苯：分析純。
    8.8 C18小柱：supelclean LC-18 Sep Pak 小柱500mg，3mL。
    8.9 SCX小柱：supelclean Lc-SCX SEP Pak小柱500mg，3L。
    8.10 標準溶液
    8.10.1 鹽酸克侖特羅儲備液：精確稱取適量的鹽酸克侖特羅標準品，用氨化甲醇配成濃度約1mg/mL的標準儲備液。
    8.10.2 鹽酸克侖特羅標準工作液：將儲備液用氨化甲醇稀釋為v(0.05-2.0) μg/ml，存放在冰箱中備用。

    9 儀器及設備
    9.1 離心瓶，50mL，具塞。
    9.2 Sep-Pak真空接頭。
    9.3 具聚四氟乙和稀擰蓋的試管。
    9.4 勻漿機。
    9.5 機械真空泵。
    9.6 旋渦混合器。
    9.7 恒溫箱，精度為±3℃。

    10 操作方法
    10.1 提取
    準確稱取已絞碎的動物肝臟樣品（10±1.0）g，于50mL具塞的離心管中。加入20mmol/L的乙酸緩沖溶液20mL，均質5分鐘。加入50μLβ-3000rpm離心5分鐘，過濾上清液，收集濾液。
    10.2 凈化
    裝好真空泵和接管，將C18和SCX固相萃取柱按從上到下的順序安裝。依次用5mL甲醇、5mL水、5mL甲醇淋洗柱子，在溶劑流過固相萃取柱后，保持抽氣5分鐘使柱中的液體逐漸枯竭，取下C18柱，用5mL4％氨化甲醇淋洗SCX柱并收集流出液于具塞玻璃試管中。
    10.4 檢測
    10.4.1 氣相色譜條件
    10.4.1.1 色譜條件：HP-5MS5％苯基甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm(內徑)。0.25μm（膜厚）；
    10.4.1.2 進樣口：220℃；
    10.4.1.3 進樣方式：不分流；
    10.4.1.4 進樣體積：2μL；
    10.4.1.5 柱溫：70℃（保持0.6分鐘），以25℃/分鐘升溫至200℃（保持6分鐘），以25℃/分鐘升溫至280℃（保持5分鐘）；
    10.4.1.6 載氣：氦氣，流速：0.9ml/分鐘（恒流）。
    10.4.2 質譜條件
    10.4.2.1 GC/MS傳輸線溫度：280℃
    10.4.2.2 溶劑延遲：8分鐘；
    10.4.2.3 EM電壓：高于調諧電壓200V；
    10.4.2.4 分析器溫度：230℃；
    10.4.2.5 四級桿溫度：106℃；
    10.4.2.6 選擇離子監(jiān)測（M/Z）86，243，262，277。
    10.5 測定
    根據樣品液中鹽酸克侖特羅含量情況，選定峰面積相近的標準工作溶液。標準工作溶液和樣品溶液中鹽酸克侖特羅響應值均應在儀器檢測線性范圍內。對標準工作溶液和樣品液等體積參插進樣測定。
    定性：樣品峰與標樣的保留時之差不多于3秒，Q值應大于80，當Q值小于80時，應通過人工比較選擇離子的豐度，以基峰百分數表示。
    10.6 計算

          X=h×Cs×V÷(Hs×m)
式中：X—試樣中克侖特羅殘留含量，mg/kg；
      h—樣液中經衍生化鹽酸克侖特羅的峰高，mm；
      Cs—標準工作液中經衍生化鹽酸克侖特羅的峰高，mm；
      V—樣液最終定容體積，mL；
      m—最終樣注解所代表的試樣器，g。
注：計算結果需將空白值扣除。

    11 精密度和靈敏度
    本辦法的檢測限為5μg/kg，回收率為80％±15%。

    第三篇  酶聯免疫吸附法

    12 原理
    利用固相酶聯免疫吸附原理，將鹽酸克侖特異性抗體包被于聚苯乙烯微量反應板的孔穴中，再加入稀釋的尿樣（未如抗原）及酶標鹽酸克侖特羅抗原（已知抗原），使兩者與抗體之間進行免疫競爭反應，然后加酶底物顯示色，顏色的深淺取決于抗體和酶標鹽酸克侖特羅抗原結合的量，即樣品中鹽酸克侖特羅多，則被抗體結合酶標鹽酸克侖特羅抗原少，顏色淺，反之則深。用目測法或儀器法與鹽酸克侖特羅標樣比較來判斷樣品中鹽酸克侖特羅的含量。
 
    13 試劑和材料 
    除方法另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為二次重蒸水或超純水。
    13.1 鹽酸克侖特羅酶聯免疫試劑盒：德國R-Biopham公司生產或類似產品。
    13.2 50mmol/LHCL
    13.3 50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0
    13.4 500mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0
    13.5 甲醇

    14 儀器與設備
    14.1 酶標測定儀，含有450nm的濾光片。
    14.2 水浴鍋。
    14.3 微量連續(xù)可調移液器及配厭吸頭：10μL-20μL。
    14.4 冰箱：（4-8）℃。
    14.5 離心機：0-10000rpm。
    14.6 超聲波發(fā)生器。

    15 樣制備
    15.1 均質：將5g粉碎的樣品與25ml50mmol/LHCL混合，超聲波處理10min，振蕩30min均質；
    15.2 離心：稱取6g均質物，4000rpm離心 15min，取上清液，加入300ullmol/LnaOH混合15min，加入4ml500mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH3.0），4℃保存1.5hr或過認，再次4000rpm離心15min，取上清液；
    15.3 PIDA C18柱純化：先后用3ml甲醇洗滌柱子和2ml50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH3.0）洗滌柱子，樣品進柱，再用2ml50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH3.0）洗滌柱子，正壓去除殘留流體并用空氣吹干柱子，用1mll甲醇洗脫樣品，蒸發(fā)溶劑，用0.4ml蒸餾水溶解干燥殘留，取20μL進行分析（如樣品濃壓過高，用蒸餾水進行稀釋）。

    16 測定步驟
    16.1 試劑盒和待檢樣品檢測前平衡至室溫（19-25）℃。
    16.2 每個微加入100μL稀釋后的抗體溶液，充分混合并大骯室溫孵育15min；
    16.3 倒出微孔中液體，250μL蒸餾水洗滌3次，拍干，加入20μL標準液或處理好的樣品（標準和樣品做兩個平行實驗），再加入100μL稀釋的酶標記物，充分混勻，室溫孵育30min；
    16.4 倒出微孔中液體，250μL蒸餾水洗滌3次，拍干，加入50μL基質和50μL空色劑，充分混勻，室溫暗處孵育15min；
    16.5 加入100μL反應終止液，混勻后大骯酶標儀450nm處讀吸光壓值。

    17 結果計算
    17.1 計算標準品和樣品的平均吸光值。
    17.2 以標準濃壓和對數點鐘橫坐標，吸光值點為縱坐標繪制工作曲線。
    17.3 以樣品吸光值大骯標準工作曲線上查出相對濃度，乘以樣品稀釋倍數，即為測定值。

    18 靈敏度
    本方法的檢測限為100ng/kg。

    19 其他
    19.1 試劑盒應放在（4-8）℃冰箱內保存。
    19.2 為分析人員安全，操作時要戴止醫(yī)用乳膠手套。