摘 要 高效液相色譜法測定飼料中的氫化可的松，提取方法簡單，測試數據重現性好，平均回收率高于90%，平均變異系數I小于7%，精密度和準確度均能滿足分析要求。
　　關鍵詞 氫化可的松；回收率

　　氫化可的松（Hydrocortisone）化學名為11β，17α，21－三羥基孕甾－4－烯－3，20－二酮－21－甲醇。

　　氫化可的松屬腎上腺皮質激素類藥物，主要作為人畜抗炎癥、抗過敏、抗休克，在飼料中使用能起到治病、促生長作用，對豬的增重效果明顯，但其殘留可引起類腎上腺皮質亢進綜合癥、心血管、消化系統并發癥及骨質疏松、肌肉萎縮等，嚴重威脅人們的身體健康。研究飼料中的氫化可的松檢測方法有助于加強監督管理，據此，我們研究了用甲醇提取試樣中的氫化可的松，以乙腈、水作為流動相，用高效液相色譜—紫外檢測法分離對氫化可的松進行測定。

　　1 材料與方法
　　1.1 試劑和溶液
　　1.1.1 試劑
    乙腈為色譜純、甲醇為色譜純。
　　1.1.2 氫化可的松標準液
　　1.1.2.1 氫化可的松標準貯備液
    準確稱取氫化可的松標準品（純度≥98%）0.100 0g，置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容，其濃度為1 000μg/ml的儲備液，置于4℃冰箱中保存。
　　1.1.2.2 氫化可的松標準工作液
    分別準確吸取一定量的標準貯備液（1.1.2.1），稀釋10倍，用甲醇稀釋，定容，配制成濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、17.5μg/ml的標準工作液。
　　1.2 儀器和設備
    高效液相色譜儀為配紫外檢測器、電子天平為感量0.000 1g、離心機為3 000r/min、振蕩器、玻璃具塞三角瓶為250ml、微量進樣器、微孔濾膜為0.45μm。
　　1.3 測定步驟
　　1.3.1 試樣制備
    按GB/T 14 699.1抽樣，取有代表性的樣品，四分法縮減取約200g，經粉碎全部過40目孔篩，混勻裝入磨口瓶中備用。
　　1.3.2 提取
    按不同的飼料產品，準確稱取配合飼料、濃縮飼料2~10g，預混料0.5~4g（準確至0.000 2g）樣品，置于250ml玻璃具塞三角瓶中，加入40ml甲醇，往復震蕩30min，靜止10min過濾，再向飼料中分別加入30ml甲醇，重復提取2次。合并3次提取液，用甲醇定容至100ml。取10ml置離心管中，3 000r/min離心5min，取上清液用0.45μm微孔有機濾膜過濾作為試樣制備液，供高效液相色譜分析。
　　1.3.3 測定
　　1.3.3.1 HPLC色譜條件
    色譜柱：C18柱，長240mm，內徑4.6mm(i.d.)，粒徑5.0μm，或相當者；柱溫：室溫；流動相：乙腈+水＝25+75（V+V），流速：1.0ml/min；波長：254nm，進樣體積：20μl。
　　1.3.3.2 HPLC定量測定
    按儀器說明書操作，取適量試樣制備液和相應濃度的標準工作液，作單點或多點校準，以色譜峰面積積分值定量。
　　1.3.4 確證
    對檢出氫化可的松的樣品，必須用重疊色譜分析來確證。以試樣提取液中加入適量的氫化可的松標準工作液，加入的量應與提取液中的氫化可的松的量相當。
　　依次注入樣品的提取液、氫化可的松標準工作液和添加了氫化可的松標準工作液的樣品提取液。如果添加氫化可的松標準工作液的樣品提取液樣品所產生峰的半峰寬變化不大于10%，且峰高或峰面積發生了成比例的變化，則可確證原氫化可的松峰就是氫化可的松。
　　1.3.5 結果計算與表述
　　試樣中氫化可的松的含量按式計算：
    X=m1/m*n
　　式中：X——試樣中氫化可的松的含量（mg/kg）；
      m1——HPLC試樣色譜峰對應的氫化可的松的質量（μg）；
      m——試樣質量（g）；
      n——稀釋倍數。

　　2 結果與討論
　　2.1 提取凈化條件的確定
    提取凈化條件主要指提取劑與提取方法的確定，并對提取液進行凈化以除去可能會干擾爭譜分離的飼料基質中的雜質的方法的確定。目前國內外使用最廣的提取劑有甲醇、乙腈和乙酸乙脂等，分析氫化可的松的結構和理化性質，我們采用了甲醇作提取劑，振蕩的方法進行提取，添加回收試驗取得了較好效果。由于我們采用了高效液相色譜檢測法進行測定，通過對流動相的調查，使干擾物質與氫化可的松得到了較好的分離，因此不用進一步凈化即可直接進行高效液相色譜測定，大大簡化了分析步驟。

2.2 HPLC分離測定條件與實驗參數的確定
    目前國內外反相高效液相色譜應用較多的流動相是水和乙腈或甲醇的混合液，當我們使用水、甲醇（75/25,v/v）作為流動相時，氫化可的松的峰形有些拖尾，我們用乙腈代替甲醇時，峰形得到改善，最后確定流動相為水、乙腈（75/25,v/v），不僅能取得很好的分離效果，而且氫化可的松的保留時間控制在約10min左右，也較為理想。
    在上述色譜條件下，測得氫化可的松標準溶液的色譜峰保留時間在10.0min附近，色譜峰峰形較好，靈敏度較高，譜圖如圖1。

　　3 結論
　　3.1 方法的檢測限
　　我們在飼料藥物檢測中添加標樣，通過提取、凈化和儀器分離后測定的檢測限，按2倍噪音量的信號為準，測得該方法的檢測限為0.05mg/kg。
　　3.2 方法的線性響應    　　在上述色譜條件下，將標準工作液依次從低濃度到高濃度進樣，每一濃度進樣3針，按其所得峰面積的平均值與對應的標準溶液濃度（μg/ml）作標準曲線測得氫化可的松濃度在1.0～25μg/ml范圍內，其線性回歸方程相關系數r=0.999 6，其線性響應范圍完全滿足測定的要求。
　　3.3 方法的準確度、精密度與適用范圍
    為考察方法的準確度、精密度數據與適用范圍，分別以未添加氫化可的松的空白豬配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料為樣品，進行了氫化可的松的添加回收試驗。設計5mg/kg、25mg/kg、75mg/kg、125mg/kg4個添加水平，濃縮飼料和添加劑預混合飼料分別設4個添加水平，每個水平作3個重復，測得的添加回收率及結果的變異系數見表1。

　　從表中試驗數據結果可以看出，本方法不僅有較高的添加回收率（平均91.8%）和較好的精密度（平均變異系數為6.11%），而且能適合不同種類飼料中氫化可的松的測定；另外，從空白飼料樣品的色譜圖和添加飼料樣品的色譜圖（見圖2）可以看出，氫化可的松色譜峰附近沒有雜質峰，說明飼料中的雜質對本測定方法沒有干擾。

　　本方法進行了驗證實驗結果表明本方法的再現性，回收率高，符合要求。

　　參考文獻（略）