摘要：利用免疫親和柱熒光光度法測(cè)定了飼料中玉米赤霉烯酮，檢測(cè)靈敏度為0.1mg/kg，檢測(cè)范圍為：0～5mg/kg，變異系數(shù)為3.3%～13.3%，在其檢測(cè)范圍內(nèi)的回收率為97%～106%，分析1個(gè)樣品的時(shí)間只需25min。
    關(guān)鍵詞：玉米赤霉烯酮；飼料；檢測(cè)

    玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種雌激素真菌毒素，化學(xué)名為6-（10羥基-6氧基-1-炭稀基）β-雷瑣酸-μ-內(nèi)脂，是一種白色的結(jié)晶，分子式為C₁₈H₂₂O₅，分子量為318；熔點(diǎn)為164～165℃；紫外線光譜最大吸收236nm、274nm和316nm；紅外線光譜最大吸收為970nm。純的玉米赤霉烯酮不溶于水、二硫化碳和四氯化碳；溶于堿性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、醋酸乙酯、乙腈和乙醇；微溶于石油醚（b.p.30～60℃），在紫外線照射下呈藍(lán)綠色（劉繼業(yè)，2001）。
    米赤霉烯酮最初是從赤霉病玉米中分離出來(lái)的，有15種以上的衍生物，其主要存在于玉米和玉米制品中，小麥、大麥、高粱、大米中也有一定程度的分布，ZEN主要污染玉米、麥類、谷物等，在世界各地各種糧谷與飼料中均有存在。
    玉米赤霉烯酮具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對(duì)家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。
    目前玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法有薄層色譜法（Quiroga等，1994；楊曙明等，1994）、氣相色譜法-質(zhì)譜（Bennett等，1994）、酶聯(lián)免疫吸附法（Bagnati等，1991）等。Fazekas等(2001)和Visconti等(1998)利用免疫親和柱-HPLC法測(cè)定了玉米樣品中的玉米赤霉烯酮，Scott等(1999)利用免疫親和柱-熒光法和免疫親和柱-HPLC法快速測(cè)定了玉米樣品中的玉米赤霉烯酮。本研究中采用玉米赤霉烯酮免疫親和柱對(duì)樣品中的玉米赤霉烯酮進(jìn)行特異性的吸附分離，然后用已標(biāo)定好的熒光計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)。

    1 材料與方法
    1.1 試劑與溶液
    1.1.1 甲醇：色譜純，美國(guó)J.T.Baker。
    1.1.2 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma。
    1.1.3 氯化鈉，分析純。
    1.1.4 磷酸氫二鈉，分析純。
    1.1.5 磷酸二氫鉀，分析純。
    1.1.6 氯化鉀，分析純。
    1.1.7 吐溫-20，分析純。
    1.1.8 0.1%吐溫-20/PBS緩沖液：稱取8.0g NaCl+1.2g Na₂HPO4+0.2gKH2PO4+0.2g KCl，用990 mL純水將上述試劑溶解，加入1mL的吐溫-20，然后用濃HCl調(diào)pH至7.0，最后用純水稀釋至1000mL。
    1.1.9 玉米赤霉烯酮衍生液：美國(guó)Vicam（用50mL的色譜級(jí)甲醇將2.5g的固態(tài)六水氯化鋁AlCl₃·6H₂O完全溶解，該衍生液在室溫下可存放1個(gè)月）。
    1.1.10 硫酸溶液（0.05mol/L）：美國(guó)Vicam（取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000mL，此溶液標(biāo)定熒光計(jì)其讀數(shù)相當(dāng)于0μg/L玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液）。
    1.1.11 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液：美國(guó)Vicam（稱取3.40g二水硫酸奎寧用0.05mol/L硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液標(biāo)定熒光計(jì)其讀數(shù)相當(dāng)于450μg/L玉米赤霉烯酮溶液）。
    1.2 儀器設(shè)備
    1.2.1 熒光計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm）：美國(guó)Vicam。
    1.2.2 高速均質(zhì)器：18 000～22 000 r/min，美國(guó)Vicam。
    1.2.3 玉米赤霉烯酮免疫親和柱：美國(guó)Vicam。
    1.2.4 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.0μm，英國(guó)Whatman。
    1.2.5 玻璃注射器：10mL，20mL。
    1.2.6 玻璃試管：直徑12mm，長(zhǎng)75mm，無(wú)熒光特性。
    1.2.7 空氣壓力泵。
    1.3 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)
    在激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0mg/L；以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為0.45mg/L。
    1.4 樣品處理
    1.4.1 提取：準(zhǔn)確稱取經(jīng)過(guò)磨細(xì)（粒度小于2mm）的試樣20.0g于250mL具塞錐形瓶中（玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品添加試驗(yàn)：計(jì)算好所需要添加的體積，取一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品于250mL具塞錐形瓶中，用氮?dú)獯蹈桑缓蠹尤?0.0g試樣）。加入2.0g氯化鈉及準(zhǔn)確加入50.0mL（V1）甲醇-水（8+2），以均質(zhì)器高速攪拌提取2min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取10.0mL（V2）濾液并加入40.0mL（V3）0.1%吐溫-20/PBS緩沖液稀釋，用1.0μm的玻璃纖維濾紙過(guò)濾，取10.0mL濾液備用。
    1.4.2 凈化：將玉米赤霉烯酮免疫親和柱連接于10.0mL玻璃注射器筒下。準(zhǔn)確移取10mL（V4）上述濾液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約2～3mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱（不要超過(guò)5mL/min流速）。用10.0mL 0.1%的吐溫-20/PBS緩沖液清洗，再以10.0mL水分別清洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0mL（V）色譜級(jí)甲醇將免疫親和柱吸附的玉米赤霉烯酮洗脫，流速為1～2mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供熒光光度計(jì)定量測(cè)定用。
    1.4.3 測(cè)定
    取上述凈化后的1.0mL甲醇洗脫液加入1.0mL玉米赤霉烯酮衍生液，混勻，插入熒光光度計(jì)中，5min后儀器自動(dòng)讀取樣液中玉米赤霉烯酮衍生液的濃度c1（mg/L）。用水或者空白樣品代替試樣，按上述步驟做空白試驗(yàn)，測(cè)得濃度為c0（mg/L）。
    1.5 測(cè)定結(jié)果的計(jì)算
    檢測(cè)結(jié)果按公式（1）和（2）計(jì)算：

    …………（1）

    …………（2）

式中：X₁- 試樣中玉米赤霉烯酮的含量/（mg/kg）；
      c₁- 試樣中玉米赤霉烯酮的含量/（mg/L）；
      c₀- 空白試驗(yàn)玉米赤霉烯酮的含量/（mg/L）；
      V- 最終甲醇洗脫液體積/mL； 
      W- 最終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量/g；
      m- 試樣稱取量/g；
      V₁- 樣品和提取液總體積/mL；
      V₂- 稀釋用樣品濾液體積/mL；
      V₃- 稀釋液體積/mL；
      V₄- 通過(guò)親和柱的樣品提取液體積/mL。

    2 結(jié)果與討論
    2.1 回收率試驗(yàn)（表1）

表1 配合飼料中玉米赤霉烯酮的添加回收率

添加水平/(mg/kg)	檢測(cè)結(jié)果/(mg/kg)							平均值/(mg/kg)	標(biāo)準(zhǔn)偏差	回收率/%	變異系數(shù)/%
	1	2	3	4	5	6	7
0.1	0.09	0.12	0.09	0.11	0.09	0.09	0.09	0.097	0.0129	97	13.3
1.0	1.0	1.2	1.0	1.2	0.9	0.9	1.1	1.043	0.127	104	12.2
2.0	2.0	2.2	1.9	2.3	2.3	2.0	2.1	2.11	0.158	106	7.5
5.0	5.3	5.2	5.2	4.9	5.3	5.4	5.4	5.24	0.172	105	3.3

    2.2 實(shí)際樣品的檢測(cè)應(yīng)用 利用免疫親和柱-熒光法測(cè)定150個(gè)玉米原料、混合豬飼料、混合雞飼料、混合蝦飼料，發(fā)現(xiàn)玉米赤霉烯酮的含量在0～4.8mg/kg之間。玉米赤霉烯酮在玉米原料和飼料中含量的分布情況見(jiàn)表2，由此可見(jiàn)玉米原料和飼料中普遍存在有玉米赤霉烯酮。其中，玉米赤霉烯酮含量在0.1～1.0mg/kg之間，比例最高，而且超過(guò)1mg/kg的比例也比較高。所以，飼料廠及養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該經(jīng)常檢測(cè)玉米赤霉烯酮，以便能夠及時(shí)采取措施，防止對(duì)豬、牛的生長(zhǎng)和生殖產(chǎn)生不良影響，而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

表2 玉米赤霉烯酮在玉米原料和飼料中含量的分布情況

    2.3 從表1中可以看到，免疫親和柱-熒光法測(cè)定玉米赤霉烯酮的檢測(cè)靈敏度為0.1mg/kg，檢測(cè)范圍0～5mg/kg，在其檢測(cè)范圍內(nèi)的回收率為97%～106%，變異系數(shù)為3.3%～13.3%。如果玉米赤霉烯酮的含量超過(guò)5mg/kg，可以將樣品取樣量減少1倍或者2倍，其他操作步驟不變，最后熒光計(jì)測(cè)定的結(jié)果剩以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)2或者3即為樣品的實(shí)際濃度值。
    致謝：本試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)由美國(guó)大豆協(xié)會(huì)提供，試驗(yàn)期間得到了美國(guó)大豆協(xié)會(huì)專家的大力支持，在此一并感謝。

王 雄 王 津 （北京中檢維康技術(shù)有限公司）
程宗佳 博士 （美國(guó)大豆協(xié)會(huì)北京辦事處飼料技術(shù)主任）