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黃曲霉毒素的傳統去毒方法和生物降解研究進展

  作者: 來源: 日期:2009-04-20  
     據統計,全世界每年約有25%的農作物發生霉變,而對人畜引起的危害更是難以統計。據聯合國糧農組織估算,全世界由于霉菌毒素污染造成的損失,每年達數千億美元(計成, 2007)。在霉菌毒素中,黃曲霉毒素AFT(

    Aflatoxin)毒性最強。黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)真菌產生的次級代謝產物,具有極強的毒性。Aspergillus屬中的其它一些菌株也會產生黃曲霉毒素,如A.nominus,A.tamarii和A.pseudotamarii(Alberts et al.,2006)。其中,黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最強,具有致癌,致畸,引起肝中毒的作用(Guengerich等, 1996)。AFB1廣泛存在于飼料原料中,例如花生粉,豆粕,棉籽粕,玉米,高粱等。在各種畜禽中,對黃曲霉毒素最敏感的是家禽,其次是仔豬和母豬。幼畜對黃曲霉毒素的敏感度又高于成年家畜。因此,在動物生產中,一旦日糧被黃曲霉毒素污染,輕則導致動物體增重降低,飼料轉化率下降,重則誘發腫瘤和癌癥,甚至死亡,從而造成嚴重的經濟損失。因此自1960年發現黃曲霉毒素以來,科學工作者便對黃曲霉毒素的解毒進行了大量的研究。

    1黃曲霉毒素傳統去毒方法研究進展

    1.1堿處理:包括氨化法和氫氧化鈉法。

    氨化法適合含水量較高的青綠或青貯飼料,去毒有效率高達98%,但不適合籽實、餅粕等低水分原料,而且處理后原料殘留有大量氨。氫氧化鈉法適用于植物油解毒,但是設備投資大、成本高,已逐漸被淘汰(Natarajan等,1992);

    1.2氧化處理法

    常用氧化試劑有次氯酸鈉、臭氧、過氧化氫及氯氣等。此外紫外光法也是利用紫外線的強氧化作用。該方法主要問題在于處理效果不穩定,飼料中維生素等營養成分損失嚴重,處理成本較高(Rustom等,1997);

    1.3高溫法

    破壞AFT需268℃以上的溫度,能耗高,對飼料中的營養成分破壞大,實際應用很少(Hassan等,2005);

    1.4吸附劑脫毒

    常用吸附劑包括酵母細胞壁,硅鋁酸鹽等。這種方法不能解除黃曲霉毒素的毒性,且可能通過吸附作用而降低營養物質的利用率(Phillips等,1995)。飼料行業目前采用這種方法較多,也有許多新型的吸附劑問世,但其解毒效果還有待考察;

    1.5微生物發酵解毒

    已經發現具有解毒作用的菌株包括乳酸菌、雙歧桿菌、白腐真菌、假密環菌及黑曲霉等(Liu,2001;Shetty,2006;Orsolya,2004;Slaven,2006)。研究發現,某些通常認為是安全的微生物可能在霉菌毒素存在條件下產生某些有毒代謝產物,因此需要對使用的微生物重新進行安全性評價;

    1.6抗氧化劑的使用

    常用2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)等(Fanelli,2003)。這種方法效果有限,不能完全消除黃曲霉毒素中毒癥,而且BHT等抗氧化劑濃度均超過常規使用量的30倍以上,本身具有一定毒害作用;

    1.7采用合格原料稀釋法。

    這種方法雖然能夠有效減輕中毒癥狀和減輕其對生產性能的抑制作用,但有可能造成毒素污染范圍的擴大。

    2 霉菌毒素的理論理想降解方法

    由于以上解毒方法存在著各種缺點,不利于實際生產應用。針對實際生產中的應用,Bata等(1999)提出任何霉菌毒素去毒方法都應該滿足以下幾點要求:

    ①毒素應該被破壞或者被轉化成無毒化合物;

    ②真菌孢子和菌絲體應被破壞,這樣就不會有新的毒素產生;

    ③飼料應該保持它原有的營養水平和風味;

    ④原料的物理性狀不應被明顯改變;

    ⑤去毒加工應該經濟可行。

    研究者們發現生物酶具有作用專一性的特點,生物酶解毒具有對飼料無污染,有高度的選擇性,不影響飼料的營養價值,而且能夠避免毒素的重新產生等優點。Mishra(2003)等認為酶或酶系統可以降解黃曲霉毒素并且能夠保留飼料的營養成分與外觀。于是近些年生物酶解毒法成了研究的熱點。

    3黃曲霉毒素生物降解的研究進展

    3.1 黃曲霉毒素的微生物直接降解

    許多微生物,包括細菌、放射菌、酵母菌、霉菌和藻類都能降解黃曲霉毒素。但是降解機理是物理吸附還是生物降解作用一直受到較大爭議。El-Nezami(1998)等報道許多有關乳酸菌菌株的研究表明其解毒機理應該是吸附作用而非降解作用。朱新貴等(2001)報道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母菌、釀酒酵母菌、米曲霉和枯草芽孢桿菌均對黃曲霉毒素有降解作用,但由于是用發酵液進行解毒實驗,所以無法確定其解毒機理是生物降解作用,還是菌體的吸附作用。Ciegler等(1996)曾報道Nocardia corynebacterioides和Mycobacterium fluoranthenivorans菌均可以有效的降解AFB1。

    3.2 黃曲霉毒素的微生物代謝物的酶解降解

    早在70年代末,Doyle和Marth(1979)就發現了寄生曲霉(A.Parasiticus)能夠產生降解AFB1的過氧化物酶,并報道過氧化物酶的量與AFB1被降解的量之間存在著直接的關系。之后Huynh等(1984)報道,黑曲霉(Aspergillus niger),寄生曲霉(A.parasiticus),綠色木霉(Trichoderm viride),Mucor ambiguous菌以及少數其他真菌對AFB1也有很好的降解能力。然而其中一些菌株在條件改變的情況下有可能產生AFB1。

    Elllis等(1991)指出生物降解反應會通過酶解機制發生,并且這些酶的產物或副產物會與黃曲霉毒素反應。由此推測過氧化物酶正是這一種酶,因為它可以催化氫過氧化物的分解從而產生自由基,這些自由基會與黃曲霉毒素發生反應。

    黃曲霉毒素的生物酶解降解作用機制在后來的研究人員一系列工作中得到了進一步的深入和證實。首先是國內劉大嶺(1995)研究小組做了比較多的工作,并取得了顯著成果。他們發現從真菌E-2中提取的粗酶液可使樣品中的AFB1含量減少高達80%。活性物質解毒作用的溫度、pH值及作用時間特征表明,粗酶液中起解毒作用的可能是某種酶。其次,陳儀本等(1998)研究發現,用黑曲霉(Aspergillus niger)制備的生物制劑BDA能夠降解花生油中的黃曲霉毒素,且這種活性物質的解毒作用的高效性以及對溫度、水分、時間等效應都具有生物酶的重要特征,這表明降解實質是酶促反應。考慮到酶促反應必須在水的存在下發生反應,該研究小組選擇了谷殼培養法將解毒酶固定化,從而在解決了酶制劑在含水量低的環境下難以作用的難題。隨后,Smiley等(2000)報道橙色黃桿菌(F.aurantiacum)的粗蛋白提取物在水溶液中可以降解AFB1,降解率能夠達到74.5%。而用蛋白酶K將粗蛋白提取物處理后發現解毒能力降低到34.5%,這表明蛋白對黃曲霉毒素的降解機理可能是酶促反應。

    Liu等(2001)從假密環菌(Armillariella tabescens)中分離出了一種可以脫除AFB1毒性的黃曲霉毒素解毒酶,克隆得到其基因序列,成功轉化到畢赤酵母表達系統中,并對該酶的固定化技術進行了研究。然而以上解毒酶的理想反應條件都是中性pH,高水分的體外反應體系,適合植物油、醬油、啤酒及牛奶等,難以在籽實、餅粕等低水分飼料原料中直接應用。

    Marisa(2003)等從白腐真菌和褐腐真菌的代謝產物中分離出了胞外解毒酶,研究了該酶解毒反應的最佳PH值和溫度,并將其純化。Teniola(2005)等報道了4株具有降解AFB1活性的菌。其中,紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)和Mycobacterium fluoranthenivorans sp. Nov. DSM44556菌的胞外提出物在30℃分別與AFB1混合4h后,降解率在90%以上,8h后基本檢測不到AFB1殘留。他們還對胞外提取物在熱處理和蛋白酶K處理后進行了解毒效果測定,發現降解率降低了。因此,他們認為解毒機理是酶促反應。

    3.3黃曲霉毒素的微生物菌體直接吸附、代謝解毒和酶解降解的聯合作用

    Alberts等(2006)報道紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的胞外粗提液與AFB1作用72h后降解率可達66.8%。而在紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)菌細胞存在的情況下,72h后AFB1只有3~6%的殘留。這是因為菌體對黃曲霉毒素具有吸附作用。

    Line等(1994)使用14C標記AFB1與橙色黃桿菌(F.aurantiacum)反應并對放射性物質進行追蹤和檢測。發現無論活細胞還是死細胞均能夠吸附AFB1,但活細胞的吸附作用遠大于死細胞的吸附作用,并且只有活細胞釋放了被標記了的CO2,這表明一定量的AFB1被菌體細胞所代謝。這種方法也為研究AFB1在動物體內的代謝途徑提供了參考。此外,他們還發現從橙色黃桿菌提出的粗蛋白物質在水溶液中可以降解74.1%的AFB1,而用熱處理失活的粗蛋白只能降解5.5%的AFB1。用脫氧核糖核酸酶I處理粗蛋白后發現可以降解80.5%的AFB1,這表明橙色黃桿菌對黃曲霉毒素的解毒并非由于與細菌DNA的非特異性結合。蛋白酶K處理后的粗蛋白可以降解34.5%的AFB1,表明解毒機理有可能是酶促反應。

    4 結語

    以上研究均證明了黃曲霉毒素是可以通過生物酶降解作用得以去除的。并且在溫和的條件下生物酶的解毒不會產生其它有毒的化學物質,也不會損失或極少地損失飼料中的營養物質。雖然黃曲霉毒素的生物降解研究已經有了很大進展,但是由于酶作用條件苛刻等原因, 離實際生產應用還有很長一段距離。目前,在國內外生物學方法降解黃曲霉毒素在飼料工業中的應用非常少。國內研究者陳儀本(1998)等提出應用生物學方法降解黃曲霉毒素的技術關鍵在于:①篩選出能產高活性黃曲霉毒素解毒物質(主要是酶);②在原料中創造一個有利于酶促反應的含水微環境。

    因此,篩選出能夠產高效降解黃曲霉毒素的酶的菌株以及通過酶工程、基因工程等手段獲得解毒作用條件更寬的解毒酶是未來研究的方向。

 
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