（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018）
摘要 本文簡(jiǎn)述了如何以膠體金免疫層析技術(shù)，構(gòu)造雞傳染性法囊病快速診斷試紙。該試紙主要由測(cè)試端、顯色區(qū)和手柄端3部分構(gòu)成，能在很短的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)雞傳染性法氏囊病的診斷，且無(wú)需任何儀器設(shè)備，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感、特異的特點(diǎn)。
關(guān)鍵詞 雞傳染性法囊病；快速診斷試紙；膠體金；免疫層析
雞傳染性法氏囊病（IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病。自1957年在美國(guó)特拉華州的岡博羅首次發(fā)生IBD以后，幾十年來(lái)，IBD已遍及幾乎所有的養(yǎng)雞國(guó)家，給各國(guó)的養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前該病的檢測(cè)方法主要有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、熒光抗體試驗(yàn)(FA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)以及斑點(diǎn)雜交技術(shù)(Dot Blot Hybridization)等，這些方法都局限在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并且需要熟練的檢測(cè)人員，給疾病的檢測(cè)帶來(lái)極大的不便[2]。如何快速地診斷IBD就成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)擺在我們的面前。為了建立快速、敏感、特異的IBD檢測(cè)方法，本文探討了如何利用膠體金免疫層析技術(shù)構(gòu)造IBD快速診斷試紙。
1 IBD快速診斷試紙的原理
IBD快速診斷試紙首先利用的是免疫層析的原理，將抗原或抗體固定在層析介質(zhì)上，相應(yīng)的抗體或抗原通過(guò)毛細(xì)泳動(dòng)，與特異性物質(zhì)結(jié)合后即滯留在該位區(qū)，根據(jù)顯色反應(yīng)即可作出判定。顯色技術(shù)利用的是膠體金免疫檢顯色，膠體金顆粒易于制備，當(dāng)顆粒達(dá)到107/mm2時(shí)，即可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的粉紅色斑點(diǎn)，同時(shí)因其保存、使用方便而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[3]。
2 IBD快速診斷試紙的構(gòu)造
IBD快速診斷試紙根據(jù)膠體金免疫層析原理設(shè)計(jì)，由測(cè)試端、顯色區(qū)和手柄端3部分構(gòu)成，含有支撐層和反應(yīng)試劑吸附層（圖一）。測(cè)試端由玻璃纖維膜構(gòu)成，吸附相應(yīng)的抗原或抗體；顯色區(qū)由硝酸纖維膜（NC膜）構(gòu)成，其上含有判定結(jié)果的檢測(cè)線和對(duì)照線（圖二）；手柄端由吸水材料構(gòu)成。
3 IBD快速診斷試紙的研制思路
在測(cè)試端玻璃纖維膜上包被金標(biāo)記鼠抗IBDV單克隆抗體（Au-Ab1），在顯色區(qū)NC膜的檢測(cè)線和對(duì)照線處分別包被鼠抗IBDV單克隆抗體（Ab1）和兔抗鼠IgG多克隆抗體（Ab2）。
若待檢液中含有IBDV，當(dāng)待檢液進(jìn)入測(cè)試端時(shí)，其中的Au-Ab1和IBDV形成Au-Ab1—IBDV的復(fù)合物，復(fù)合物在NC膜上層析泳動(dòng)，被檢測(cè)線處的Ab1攔截，形成Au-Ab1—IBDV—Ab1的復(fù)合物，并在檢測(cè)線處形成棕紅色的條帶；測(cè)試端多余的Au-Ab1在NC膜上繼續(xù)層析泳動(dòng)，被對(duì)照線處的Ab2捕獲，形成第二條棕紅色的條帶。若待檢液中不含IBDV時(shí)，測(cè)試端的Au-Ab1在NC膜上層析泳動(dòng)，不能被待檢線處的Ab1攔截，直接與對(duì)照線處的Ab2結(jié)合，僅形成一條棕紅色的條帶。
4 IBD快速診斷試紙的制作
4.1 鼠抗IBDV單克隆抗體的制備 用純化的IBDV抗原免疫8日齡的Balb/c小鼠50ug/只，首次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑乳化抗原，共免疫2—3次，每次免疫間隔2—6周。當(dāng)用ELSA檢測(cè)抗IBDV血清抗體效價(jià)＜10-4時(shí)，用50ug純抗原尾靜脈超強(qiáng)免疫，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，經(jīng)小鼠腹腔誘生腹水，proteinG柱層析提純IgG[4]。
4.2 兔抗鼠IgG多克隆抗體的制備 首先將Balb/c小鼠的血清采用辛酸—硫酸銨法加以純化，以獲得較純的小鼠IgG。具體過(guò)程為：離心后的1份血清用2份0.01M PH7.4 PBS稀釋，邊攪拌邊加入50%飽和硫酸銨，4℃靜置30min，6000r/min離心30min，沉淀用0.06 M PH4.8醋酸鹽緩沖液溶解至原體積，室溫下邊攪拌邊加入辛酸（30ul/ml血清），4℃澄清2h，13000r/min離心30min，棄沉淀。上清液調(diào)PH至7.4，在加入35%飽和硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，重復(fù)兩次。沉淀物用少量PBS溶解，4℃PBS透析過(guò)夜，其間換液3～5次。然后以獲得的較純的小鼠IgG作為抗原，加上適量的佐劑，免疫健康的家兔，取血清，再次用辛酸—硫酸銨法純化，即制得兔抗鼠IgG多克隆抗體[5]。
4.3 膠體金的制備 將氯化金（又名氯酸金，HAuCl4）溶解于雙蒸水中配制成0.01%的水溶液；取0.01%的HAuCl4水溶液加熱至沸騰，迅速加入1%的檸檬酸鈉水溶液4ml，約5分鐘后出現(xiàn)橙紅色，即制成所需要的膠體金顆粒，4℃?zhèn)溆谩3]
4.4 鼠抗IBDV單克隆抗體的標(biāo)記 取1mg純化的鼠抗IBDV單克隆抗體，邊攪拌邊注入到50 m1膠體金溶液中，室溫下攪拌1 h。加10％牛血清白蛋白(BSA) 2 m1(終濃度為0.4％)，室溫下攪拌5 min。加10％聚乙二醇〔PEG2000〕1m1(終濃度為0.2％)，室溫下攪拌5 min 。12000～15000 r／min離心50 min，沉淀溶于5ml保存液中。用濾膜過(guò)濾， 4℃冰箱保存被用。
4.5金標(biāo)記鼠抗IBDV單克隆抗體玻璃纖維膜的制備 取3 m1金標(biāo)記鼠抗IBDV單克隆抗體，加3 m1稀釋液混勻。放入玻璃纖維素膜浸泡10 min，取出置37℃烤箱中烤干，熱合封口，置4℃冰箱備用。
4.6抗體硝酸纖維素膜(NC膜)的制備 在NC膜的檢測(cè)線和對(duì)照線處分別包被鼠抗IBDV單克隆抗體和兔抗鼠IgG多克隆抗體。 將抗體硝酸纖維素膜置封閉液中，37℃水浴鍋中孵育1h。取出抗體硝酸纖維素膜浸泡在洗滌液中洗2次，室溫下風(fēng)干，置4℃保存?zhèn)溆肹6]。
4.7 IBD快速診斷試紙的組裝 將所需材料剪成相應(yīng)尺寸大小，即手柄端4mm×20mm，抗體硝酸纖維素膜( 顯色區(qū))4mm×20mm，金標(biāo)記鼠抗IBDV單克隆抗體玻璃纖維膜4mm×5mm，待加樣（即圖一的max處）玻璃纖維膜4mm×15mm。
然后將這些材料組裝成圖一所示的IBD快速診斷試紙。
5 IBD快速診斷試紙的檢測(cè)步驟
5.1 采樣 取出待檢雞的法氏囊，置于某一容器內(nèi)，然后加入生理鹽水或干凈的自來(lái)水，充分剪碎或勻漿，靜置5min。
5.2 檢測(cè) 從4℃冰箱取出IBD快速診斷試紙，恢復(fù)到室溫；手拿試紙的手柄端，將測(cè)試端插入組織懸液得上清液中（勿使液面超過(guò)max線），NC膜吸滿液體時(shí)，取出試紙平放1—5min，觀察NC膜的顯色情況。
5.3 結(jié)果判斷 試紙的NC膜上出現(xiàn)兩條棕紅色線時(shí)，判為陽(yáng)性，即該雞感染IBDV；只出現(xiàn)一條棕紅色對(duì)照線時(shí)（靠近手柄段）判為陰性，即該雞未感染IBDV；不出現(xiàn)任何棕紅色線時(shí)，表示操作有誤或試紙失效。
6 IBD快速診斷試紙的應(yīng)用前景
近年來(lái)，IBD已成為危害養(yǎng)雞業(yè)的主要傳染病，由于IBD感染的雞群多呈亞臨床感染和其它病原體混合感染而影響確診，使臨床剖檢和常規(guī)的AGP方法難以滿足臨床診斷的需要。而IBD快速診斷試紙使用方便，并且具有快速、敏感、特異的特點(diǎn)，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。相信在不久的將來(lái)，IBD快速診斷試紙必能廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，為IBD的快速診斷做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。另外，我們利用膠體金免疫層析技術(shù)，還可研制出其他疾病的快速診斷試紙，使之更好地為動(dòng)物檢疫、疾病的防治服務(wù)。
參 考 文 獻(xiàn)
1 蔡寶祥主編，家畜傳染病學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999，269~271.
2 莊向生，等.中國(guó)獸醫(yī)科技，1994，24：3~5.
3 殷震，等主編. 動(dòng)物病毒學(xué)，科學(xué)出版社，1997，278~282.
4 杜念興主編.獸醫(yī)免疫學(xué)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999，56~58.
5 王毅.河北醫(yī)藥，1994，16：381~382.
6 魏梅生，等.植物檢疫，2002，2：81~83.
