摘要：家畜早期胚胎的性別鑒定是家畜胚胎移植的重要內容，對實現動物性別的人為控制具有重要意義。近年來隨著性別鑒定技術的不斷發展，出現了許多鑒定方法。本文對性別決定基因、動物性別決定機理和早期胚胎性別鑒定的方法作一簡要綜述，特別是對ＰＣＲ方法在胚胎性別鑒定中的應用及其基本過程作一簡述。

　　關鍵詞：性別決定基因；胚胎性別鑒定；聚合酶鏈式反應

　　中圖分類號：Ｓ８１４．７文格標識嗎：Ａ文章編號：０２５８一7033（2002）04-0048-03

　　許多畜牧獸醫工作者一直在為實現動物性別的人為控制進行著不懈的努力。動物性別控制主要采用兩條途徑，即Ｘ精子與Ｙ精子的分離和胚胎性別的鑒定。在前者尚未取得完全成功的情況下。胚胎的性別鑒定成為性別控制的主要途徑。家畜胚胎的性別鑒定技術是家畜胚胎移植技術的一項重要內容，是新的更高的目標之一。通過移植已知性別的胚胎，控制家畜后代的性別比例，能加快優良母畜的繁殖速度，促進高效畜牧業的發展。在養牛業上，結合胚胎分割，胚胎冷凍等動物繁殖技術，幫助選育優良母牛和增加牛奶產量。近年來，隨著轉基因家畜的研究進展，人們也希望能按照家畜性別比例的要求，有選擇的進行所需性別的轉基因家畜的研究和開發。早期胚胎的性別鑒定，使得人們的愿望得以實現。另外，在體外受精和胚胎操作技術日趨完善的今天，也迫切需要建立能與胚胎產業化相配套的性別鑒定技術。

　　１動物性別決定的分子機理

　　1.1動物的性別決定基因——ＳＲＹ基因自古以來個體性別決定的機理一直是胚胎學的重大研究課題之一，隨著分子生物學和發育生物學及其它相關學科的發展，人們從本質上對性別決定有了一些較為清楚的認識。Ｓｉｎｃｈａｒ等（1990）發現在哺乳動物Ｙ染色體上存在性別決定區（Sex determining region of Y）[1]，即ＳＲＹ基因。當將攜帶ＳＲＹ基因的一段基因組片段作為轉基因導入ＸＸ小鼠胚胎，實現了由雌性向雄性的性反轉，證明了ＳＲＹ基因為哺乳動物的性別主宰基因[2]。人們深入的研究了ＳＲＹ基因的結構和功能，它位于Ｙ染色體短臂，從著絲粒到端粒與擬常染色體區相鄰的３５Ｋｂ的范圍內。人類的ＳＲＹ基因只有一個外顯子，長８５０ｈｐ，該基因有一個多聚腺苷酸位點和兩個轉錄起始點，其間是一個可讀框，可編碼204個氨基酸，其中包含可編碼７９個氨基酸的保守區——ＨＭＧ盒[3]。ＳＲＹ基因的ＨＭＧ盒在哺乳動物間具有高度的同源性，如牛ＳＲＹ基因的ＨＭＧ盒和人類的同源性達８４％。

　　1.2動物性別決定的機理未分化的性腺中胚層處于中性，如果Ｙ染色體存在，ＳＲＹ基因將自啟動轉錄，在胚胎睪丸組織細胞系中表達產生ＳＲＹ因子。ＳＲＹ因子主要產生三方面的作用：一是激活下游的苗勒氏體抑制物基因ＭＩＳ（副中腎抑制基因）表達，從而抑制苗勒氏管的發育；二是抑制或對抗DSS（逆性別劑量敏感基因）基因產物，進而抑制卵巢發育；三是作用于間質細胞，使之分泌睪酮，使胎兒雄性化，導致陰莖、陰囊和其他雄性器官的形成。對于雌性動物，由于ＳＲＹ基因的缺少，使得Ｘ染色體短臂上ＤＳＳ位點基因轉錄，促進卵巢發育，而卵巢產生的雌激素使苗勒氏管發育成輸卵管、子宮、子宮頸、陰道等。

　　ＳＲＹ基因僅僅是涉及性別決定過程的基因之一，近年來又發現和克隆了許多可能參與性腺分化和發育的基因，如Ｙ染色體上鋅指結構基因（Ｚｉｎｃ－finger-Ygene,ZFY）是繼ＳＲＹ之后又一和性分化有關的單拷貝基因，并與精子的發生有關，在Ｘ染色體上存在其同源序列ZFX[4]。另外還有上面提到的ＭＩＳ。ＤＳＳ基因以及ＳＲＹ基因的相關基因ＳＯＸ基因家族等。

　　２家畜早期胚胎的性別鑒定

　　由于胚胎性別鑒定所潛在的巨大的經濟效益以及其重大的意義，所以各國研究人員在該領域進行了深入的研究，目前已發展了許多胚胎性別鑒定的方法。

　　２．１細胞生物學方法（染色體核形分析）主要是利用Ｘ、Ｙ染色體在形態上的差異，通過判定胚胎細胞性染色體是Ｘ還是Ｙ來鑒定胚胎的性別。該方法缺點或存在的困難是分析性染色體需要用分裂中期的細胞，而從桑葚期和囊胚期的胚胎里取出較多的分裂球才能獲得處于分裂中期的細胞，這要降低胚胎性別鑒定后移植妊娠率。

　　２．２免疫學方法 在８一細胞期至早期胚泡期，哺乳動物的雄性胚胎表達一種雌性胚胎所沒有的細胞表面因子，即Ｈ-Ｙ抗原，利用Ｈ-Ｙ抗原和抗體免疫反應的原理可以進行胚胎的性別鑒定。

　　２．２．１胚胎的細胞毒性分析[5,6] 在補體（如豚鼠血清）存在的情況下，Ｈ－Ｙ抗體可以與ＨＹ+胚胎（雄性胚胎）結合，并使其中的一個或更多的卵裂球溶解，或使卵裂球呈現不規則的體積和形狀，阻滯胚胎發育，受影響的胚胎即為雄性胚胎，將經培養后發育正常的雌性胚胎進行移植就可使母畜只生雌性后代。但這種方法是以破壞雄性胚胎為代價，而且其準確率不高，經這種方法鑒定的Ｈ-Ｙ+鼠胚胎移植后所生仔鼠只有８５％為雌性，這種方法很少被使用。

　　２.２.２間接免疫熒光分析法[5,6]以Ｈ-Ｙ抗體為一抗，用FTTC標記的Ｙ球蛋白（如山羊抗鼠Ｙ球蛋白）作為二抗，將上述兩種抗體依次與胚胎共同培養，雄性胚胎上的Ｈ-Ｙ抗原先與一抗結合，一抗再與二抗結合，然后通過洗滌將未結合到胚胎上的二抗洗去，由于二抗用FTTC標記，故在熒光顯微鏡下顯熒光，雄性胚胎顯熒光，不顯熒光者為雌性胚胎。這是一種非損害性胚胎性別鑒定法，鑒定過的胚胎都可以存活。但準確率不高，牛83％、綿羊為83％、豬為81％。

　　２．２.３ 囊胚形成抑制法利用Ｈ-Ｙ抗體能夠可逆性抑制囊胚形成的原理，將Ｈ-Ｙ抗血清與桑葚胚共培養，一段時間后雄性胚胎由于具有Ｈ-Ｙ抗原被Ｈ-Ｙ抗體所抑制，不能形成囊胚，而無Ｈ-Ｙ抗原的雌性胚胎則不受影響繼續發育成囊胚，因此可以將雌、雄胚胎分開。然后可洗去Ｈ－Ｙ抗體，雄性胚繼續發育。這種方法鑒定的胚胎存活率與正常無異，其正確率為８０％左右。但只能檢測桑套期前的胚胎，如果胚胎已發育至囊胚，則無法鑒定。

　　２．３ 測定卵裂球Ｘ_染色體連鎖基因劑量鑒別胚胎性別[7]從胚胎中取出一個卵裂球，采用雙重微量測定法，測定其與Ｘ_連鎖的次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶（ＨＰＲT）和與常染色體連鎖的腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶（ＡＰＲＴ）的活性。由于在８一細胞階段，雌性胚胎中的兩條Ｘ染色體均有活性，因此可根據ＨＰＲT活性在基因劑量上的兩倍差異，得到ＨＰＲT與ＡＰＲT比率的雙態分布圖，因而鑒別出雄性和雌性胚胎，該方法比較繁瑣，所需時間長。

　　３ 分子生物學方法

　　３．1 ｙ-染色體特異性ＤＮＡ探針利用Ｙ-染色體特異的ＤＮＡ探針與Ｙ-染色體的ＤＮＡ進行特異性結合，以鑒定胚胎性別的一種方法。早在１９８８年，ＥｉｌｉＳ等就將牛的Ｙ-染色體ＤＮＡ重復序列探針用于牛胚胎的性別鑒定。用于檢測的方法有兩種：一種是原位雜交；另一種是用探針與ＤＮＡ提取物相結合。這種方法的準確率超過９５％。但是這些特定序列通常具有種間特異性，所以對每種動物都必需研制不同的探針。另外，原位雜交有時還需使用放射性物質，這種方法沒有被推廣。

　　3.2聚合酶鏈式反應（ＰＣＲ）應用于胚胎性別鑒定ＨｅｒＴ等（1990）首先成功建立了家畜胚胎性別鑒定的ＰＣＲ法[8]。ＰＣＲ法因其特異性強、靈敏度高、快速、簡便、經濟等優點，在家畜早期胚胎的性別鑒定中占有越來越重要的位置，其實質就是Y-染色體特異性片段或Y-染色體上的性別決定基因的檢測技術。即通過合成ＳＲＹ基因或其他Y-染色體上特異性片段的部分序列作為引物，在一定條件下進行ＰＣＲ擴增反應，能擴增出目標片段的胚胎即為雄性胚胎，否則即為雌性胚胎。由于ＰＣＲ極為靈敏，所以只要從胚胎中取出幾個細胞就可以進行性別鑒定，這對性別鑒定后胚胎移植的妊娠率沒有影響。龔榮慈，等實驗表明，只要8ｐｇ的ＤＮＡ即可檢出ＺＦＹ、ZFX序列而判定胚胎的雌雄[12]。在國內，曾溢滔，等（１９９１）就通過對牛ＳＲＹ基因的直接測序，設計引物用ＰＣＲ擴增ＳＲＹ基因來檢測奶牛胚胎的性別[9]，楊建明，等[10]（１９９５）、歐陽紅塵[11]（１９９５）等則通過擴增牛Ｙ染色體特異ＤＮＡ序列來鑒定牛早期胚胎性別，而龔榮慈，等設計了特異于牛ＺＦＹ基因的引物對奶牛基因組ＤＮＡ進行ＮestPCR來進行性別鑒定。黃淑幀，等通過擴增ＳＲＹ基因對轉基因試管牛和試管羊胚胎進行了性別鑒定，得到的轉基因牛和轉基因羊的性別和鑒定結果完全一致[13]用ＰＣＲ鑒定家畜胚胎的性別其主要程序為：①胚胎的獲取：冷凍胚胎、剛從供體牛回收的鮮胚或體外受精培養的胚胎都可以用來鑒定性別；②引物的設計：根據Ｙ染色體上的性別決定基因或特異性片段設計引物，同時設計一對公母共有基因引物作為內對照，避免假陽性的發生；③用顯微操作或徒手從胚胎中取出幾個細胞熱處理后進行ＰＣＲ擴增；④電泳檢測。能同時擴增出Y-染色體上相應片段和公母共有基因片段的胚胎即為雄性胚胎，而只能擴增出共有基因片段的胚胎即為雌性胚胎。

　　ＰＣＲ鑒定胚胎性別的研究成功，使胚胎的性別鑒定進入了一個嶄新的發展階段，但是只有進一步研究簡易快速的胚胎切割取樣技術、胚胎性別鑒定的ＰＣＲ試劑盒以及取樣胚胎的冷凍保存技術，才能達到推廣應用階段，相信在不久的將來，所有這些問題都能得到解決。