[摘要] 介紹了DNA疫苗在動物試驗研究方面的現狀，如：動物免疫試驗中動物模型的選擇、疫苗的接種途徑及其選擇、免疫學效果評價、安全性評價和DNA疫苗研究存在的問題，以及DNA疫苗在控制畜禽疾病方面的應用前景、發展趨勢。
[關鍵詞] DNA疫苗 動物免疫試驗
DNA疫苗是將含有編碼某種抗原蛋白的外源基因與質粒重組后直接導入動物細胞內，并通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的[1]。具體的講，DNA疫苗是將含有編碼抗原基因的真核表達質粒DNA，經直接接種體內后，可被體細胞攝取，并轉錄、翻譯、表達出相應的抗原，然后通過不同途徑刺激機體產生針對此種抗原的免疫應答[2]。DNA疫苗由于不需要任何化學載體，又稱為裸DNA疫苗。
DNA疫苗以核酸形式存在，這種核酸既是載體又能在真核細胞中表達抗原。DNA疫苗的這一特性，使其與傳統疫苗及基因工程疫苗等不同而被認為是一類特殊的疫苗。由于DNA疫苗既擁有亞單位疫苗和滅活疫苗的安全性，又兼備只有弱毒疫苗或重組疫苗才有的誘導細胞免疫應答的特點，因而越來越受到重視。本文介紹了DNA疫苗在動物試驗研究方面的情況。
1 動物免疫試驗
1.1動物模型的選擇
到目前為止，用于開展DNA疫苗試驗的動物模型包括魚、雞、小鼠、大鼠、家兔、貓、狗、雪貂、牛、豬以及非人靈長類動物等。選擇動物模型時該考慮以下幾點：①對于一些用于動物性疾病預防和治療的DNA疫苗，可以直接用相關動物進行試驗，如雞新城疫病毒的DNA疫苗直接使用雞作為實驗動物；②對于用于預防或治療人類或較大動物疾病的DNA疫苗，可以首先使用小動物開展最初的動物試驗，目前用于人類的一些DNA疫苗大多以小鼠為動物模型進行最初的試驗，并取得了較好效果；③選用動物模型時應該選擇對病原體較為敏感，能夠產生相應病征指標甚至死亡的動物，從而能夠更好地評價DNA疫苗的效果；④在動物試驗中發現，一些DNA疫苗在小鼠體內能夠誘導產生較強的體液免疫或細胞免疫反應，但是當使用較大動物開展同種DNA疫苗試驗時，動物的個體越大，免疫反應的效果越差。因而在開展動物試驗時，在小動物上獲得的試驗結果需要進一步擴展到較大動物。
1.2 DNA疫苗的接種途徑及其選擇
⑴肌內注射 目前大多數研究者認為，橫紋肌系統是最有效的攝取外源基因表達蛋白抗原的組織。肌肉組織具有安全、體積大、免疫接種容量大的優點，因而常被用來進行DNA免疫注射。
質粒DNA載體進入肌組織后，在肌纖維外的間質內擴散。影響擴散的主要屏障是肌束膜。
目前對DNA免疫過程中肌纖維對外源質粒攝取的具體機制尚不太清楚。Davis等[3]研究發現，預先注射心肌毒素使肌纖維處于再生狀態，有利于質粒DNA的攝取，而單核的未成熟肌纖維則無攝取質粒DNA的功能。表明只有當肌纖維分裂處于多核狀態時，肌纖維分化形成T小管系統后，才能攝取外源DNA。
肌細胞攝取DNA后可對外源DNA進行持續的表達。Wolff等(1990年)將編碼β-半乳糖糖苷酶的報告基因注入小鼠后腿肌中，經組織化學染色發現，注射區約有10-30%肌纖維染成藍色，縱向染色深度可達400um，說明肌纖維可以攝取并表達外源基因產物。表達量及其活性同DNA呈劑量依賴關系，有報道基因可持續表達19個月以上。定量PCR檢測發現，大多數質粒DNA載體可以在肌纖維內穩定持續存在和表達。此外，肌細胞合成分泌的外源抗原與產生的特異性抗體可以形成抗原抗體復合物，并沉積于樹突狀細胞表面，長期釋放抗原，誘導產生記憶性T、B細胞[4]。
肌內注射免疫在DNA疫苗的研究中獲得了廣泛的應用，對DNA疫苗的最初研究便是利用了肌肉接種這種方式。趙連三[5]、Straford等[6]研究小組分別在HIV、HBV、流感病毒和破傷風桿菌DNA疫苗的研究中使用了肌肉接種的免疫方式，從他們的研究結果來看，肌肉細胞能夠吸收表達質粒，有效地表達病原體抗原蛋白，并誘導免疫反應的產生。
⑵皮內或皮下注射 基因槍介導的皮內或皮下導入、局部皮膚表面涂布DNA疫苗與肌內注射相比，盡管皮內或皮下免疫轉染率較低，但較高的轉染率并非是決定免疫效果的唯一因素。由于皮膚組織代謝較快可導致外源基因產物的表達為一過性。但該部位具有很多抗原遞呈的細胞，通常只需要極少量的DNA疫苗即可誘發長時間的保護性免疫[7]。
利用PowderJect系統進行皮下或皮內免疫的方法已經應用到人體。Roy等[8]利用強力噴射系統將包裹了乙肝病毒（HBV） DNA疫苗的金顆粒導入皮膚細胞，結果不僅能誘導產生特異的保護性抗體，而且還能誘導細胞免疫反應。PowderJect制藥公司的科研人員也利用該系統進行HBV DNA疫苗的皮內導入，結果能夠誘導對常規HBV疫苗無反應志愿者中50%的人體內產生特異免疫反應，對于低反應者則有80%的人體內產生足量的抗體。上述的研究結果均表明皮下或皮內導入免疫是一種非常有效的方法。
為了獲得較好的免疫效果，通過皮膚局部涂布一般應考慮于免疫前去除皮膚上的角質層細胞。Liu等[9]使用快速黏離法去皮膚上的角質層細胞，然后皮膚局部共同涂布免疫HIV DNA疫苗和細胞因子表達質粒，結果誘導小鼠體內產生了高水平的特異體液免疫和細胞免疫。Watabe等[10]也在去除局部皮膚角質層細胞后將流感DNA疫苗通過皮膚局部涂布的方法免疫小鼠，結果也同樣取得了較好效果，誘導小鼠體內產生了特異的體液免疫反應和細胞免疫反應。
⑶鼻內滴注及鼻腔噴霧 粘膜是預防大多數病毒、細菌入侵的第一道屏障，在免疫預防中具有重要作用。Tadokoro等[11]考查了鼻內接種DNA疫苗后的組織定位和表達動力學，接種后2-4個星期進行的熒光原位雜交檢測表明在肺、肝、腎、脾、局部淋巴結，胚胎和食道中均檢測到質粒的存在，在肺、肝和脾中能夠檢測到特異的mRNA，而在肺部能夠檢測到特異蛋白，上述研究結果為解釋通過鼻內接種能夠誘導較強的免疫反應提供了重要信息。
Cohen（1993年）通過鼻內滴注含編碼流感病毒抗原的質粒DNA載體，來預防呼吸道病毒的感染。Okada等（1997年）向小鼠鼻內滴注含編碼HIV-1抗原的DNA載體，結果在小鼠體內誘導產生了高水平的體液免疫和細胞免疫反應，在排泄物及陰道分泌物中均可檢測到粘膜分泌型IgA，研究結果表明鼻內接種的方式能夠誘導有效的中和抗體產生。
⑷其他免疫途徑 包括口服、陰道接種、靜脈注射及腹腔注射等。靜脈注射質粒DNA表達載體，可使包括肺、脾、淋巴結、骨髓等在內的幾乎所有組織發生轉染，其中肺、脾外源基因表達率最高。腹腔注射質粒DNA表達載體，可轉染脾臟中T淋巴細胞及骨髓來源的造血干細胞。以上幾種免疫途徑均未發現對機體有何毒性損害。
1.3 DNA疫苗的接種方案
由于多數DNA疫苗在體內表達量低，持續時間長，因而DNA疫苗在動物和臨床試驗中往往需要多次免疫接種[2]。實驗已經證明多次加強免疫在小動物試驗中能夠增強免疫反應，獲得較為理想的免疫效果。另外，也可以采用DNA疫苗免疫與其他類型疫苗匹配進行免疫的策略。Ramsay等（1999年）提出初次免疫使用DNA疫苗進行肌內接種，然后用重組痘苗病毒疫苗加強免疫，發現能夠顯著提高特異的CTL反應，并能增強清除感染和抗攻擊能力。
1.4 DNA疫苗的免疫學效果評價
DNA疫苗接種后是否能誘導有效的免疫應答是評估DNA疫苗構建是否成功的關鍵指標，也是決定能否繼續開發研究的主要因素。DNA疫苗免疫效果主要從以下三個方面來加以評價：
1.4.1體液免疫反應效果評價
體液免疫的評價指標主要是實驗對象的特異性血清陽轉率、血清抗體滴度、粘膜分泌型IgA抗體滴度、B細胞功能以及間接反映體液免疫應答的細胞因子水平等。
在抗體滴度測定中常用的方法有：免疫酶分析技術（包括酶聯免疫吸附法、生物素－親和素系統法、生物素－鏈霉親和素系統法、酶聯免疫熒光法、斑點或斑點免疫結合試驗），免疫熒光技術（包括經典免疫熒光分析技術和時間分辨免疫熒光測量技術），放射免疫分析法，免疫組織化學技術，免疫印跡法以及各種經典的病毒、細菌血清學試驗（包括中和試驗、凝集試驗、空斑形成抑制試驗、血凝抑制試驗和沉淀試驗等）。
B細胞功能測定的主要指標有：B細胞增殖試驗；抗體生成細胞數測定（包括B細胞內抗體生成能力的測定及B細胞溶血空斑試驗）。
細胞因子檢測的主要指標有：IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等參與B細胞介導免疫應答的細胞因子的含量。
1.4.2細胞免疫反應效果評價
評價細胞免疫的主要指標包括T細胞功能測定，NK細胞活性測定以及間接反映細胞免疫應答狀況的細胞因子檢測。
T細胞功能測定的主要方法有：T細胞增殖反應試驗（包括3H-TdR攙入法和MTT法）和細胞毒T細胞的功能測定，包括51Cr釋放法、3H-TdR釋放法和乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗等。
NK細胞活性測定主要采用形態觀察法，核素釋放法和LDH釋放法。
細胞因子檢測的主要指標有：IFN-γ和IL-2的含量測定。
1.4.3保護率的測定
保護率是一個反映機體免疫應答的綜合指標，也是體液免疫應答與細胞免疫應答協同作用的結果。保護率測定的基本步驟是：①接種疫苗；②病原體攻擊；③免疫保護率測定（包括相對保護率和絕對保護率）。
2 DNA疫苗的安全性評價
DNA疫苗的安全性評價對于發展候選疫苗具有重要意義[2]。要將體內與體外的所有實驗數據匯總后來評價該疫苗是否足夠安全。包括疫苗所誘導產生的免疫類型、局部接種免疫病理學特征、持續時間、免疫途徑、免疫次數等都是考查對象。使用動物進行試驗必須要符合實驗室操作規范(GLP)，另外選擇動物模型要具有針對性，一些非傳統動物模型對于某些疫苗的研究具有特殊意義，同時，直接來自本動物的實驗數據更是不可或缺的。
2.1局部反應和系統毒性研究
評價系統毒性的研究必須與局部反應的評估研究相結合。評估報告應該包括以下內容：潛在的靶器官毒性（包括造血系統及免疫系統）、病理和組織病理以及總的評價。局部反應的研究應該包括來源于注射部位組織活檢或尸檢報告的詳細資料。另外評估試驗的內容還應包括疫苗接種后在組織中特異性的分布情況，疫苗在宿主細胞存在及表達的持續時間及強度。考查的內容還包括DNA疫苗中含有的細菌蛋白污物能否誘導產生相應的免疫反應。
2.2遺傳毒性研究
質粒DNA整合到機體基因組上在理論上是有可能的，質粒DNA的整合將有可能活化癌基因，同時抑制抑癌基因，從而導致插入突變；另外質粒DNA的插入還會導致染色體不穩定，發生斷裂和重組。評價重組可能性的研究應將重點放在質粒DNA是否會與內源性的宿主DNA發生重組，設計試驗時要使用最敏感的檢測方法，例如使用PCR法來檢測其組織分布性.
疫苗接種后，要對疫苗的分布進行定位。在可能的情況下，對預期的接種途徑（如皮下、肌內、鼻內及血管內）都要進行測試。要用最敏感的方法對質粒DNA在接種部位及末梢組織中的存在進行檢測和評估。
DNA疫苗過量表達的抗原產物也應引起重視。超量表達可能會對免疫系統產生異常的活化作用，發生急性或慢性炎癥反應，導致自身免疫反應和正常組織受損。
2.3生殖毒性研究
質粒DNA疫苗有可能遷移到機體性腺組織，可能使生殖細胞發生變異。因而有必要使用PCR法檢測來源于同胎的雌性及雄性動物性腺的DNA樣本。如果所使用的DNA疫苗有可能影響到機體妊娠和胚胎發育等生理過程，就要進行進一步研究，這在人的藥品開發中尤為重要。
2.4腫瘤發生相關性研究
如果研究的結果顯示DNA疫苗具有整合活性和廣泛的組織分布或者出現了危險的慢性表現，就應對該疫苗腫瘤發生的可能性進行評估。主要的研究焦點是質粒DNA載體是否與機體基因組有著廣泛的同源序列，載體上是否包含有已知潛在致瘤性的序列。
2.5疫苗佐劑和接種設備的安全性評價[12]
對于需要使用免疫佐劑的接種方案，應該開展相應的臨床前研究以確保這種組合的安全性。對于那些還未獲得許可的佐劑和簡化免疫方案的特殊組合也需要獲得許可。
3 DNA疫苗研究中存在的問題
目前DNA疫苗研究取得了重大進展，DNA疫苗運用到動物模型上已經取得了較好的效果，而且幾乎在所有的動物試驗上并未發現有任何副作用。但是還有很多的問題需要解決，如疫苗的質量控制、質量標準及安全性等。其中最為重要的是安全性問題[13]，主要有以下幾個方面。
3.１ 質粒ＤＮＡ可能誘導自身免疫反應 盡管人和動物的許多試驗表明質粒ＤＮＡ誘發自身免疫性疾病的可能性較小，而且目前已有一項ＤＮＡ疫苗的接種研究表明，免疫動物血清中未檢測到抗ＤＮＡ抗體，但在ＤＮＡ疫苗試驗時，仍應進行抗ＤＮＡ抗體的檢測。
3.２ 持續表達外源抗原可能產生一些不良后果 質粒長期過高水平地表達外源抗原，可能導致機體對該抗原的免疫耐受或麻醉。在成年動物，尚未見到因ＤＮＡ疫苗接種而誘發免疫耐受的例子。但新生動物的免疫系統尚未成熟，可能將外源抗原認為是自身成分而形成耐受。另外，持續低水平表達的抗原可能會被血中的中和抗體清除，不能引起足夠的免疫應答，從而使疫苗的預防作用得不到充分的體現。
3.３ 肌肉注射質粒后，僅有很少部分被肌細胞所攝取，反復用ＰＣＲ技術檢查血中質粒，結果為陰性，揭示肌注后逸入血流的疫苗質粒數量是微不足道的，質粒去向如何尚待進一步闡明。
3.４ 影響核酸疫苗誘發機體免疫應答的因素很多，目前已知的主要有載體設計、核酸疫苗的導入方法、佐劑及輔助因子會對其免疫效果有影響。另外年齡和性別因素、肌注劑量和體積、預先注射蔗糖溶液等都會對肌注質粒ＤＮＡ的表達有影響。
3.５外源ＤＮＡ注入體內后，可能整合到宿主基因組上，使宿主細胞抑癌基因失活或癌基因活化，使宿主細胞轉化成癌細胞，這也許是核酸疫苗的諸多安全性問題中最值得深入研究的地方。Whalen等認為：通常用于實驗核酸免疫的劑量（100ug質粒）相當于1013拷貝，當注入肌肉后，絕大部分被降解和清除，但此問題仍待進一步研究證明。
4 DNA疫苗在畜禽疾病控制中的應用前景與發展趨勢
目前，隨著人們對DNA疫苗的研究日益深入，在人用DNA疫苗的研究方面已取得了巨大的成功。美國ＦＤＡ已批準乙肝疫苗等１０余種ＤＮＡ疫苗進入臨床試驗，其中艾滋病和Ｔ細胞淋巴瘤的核酸疫苗已進入了臨床前階段，前列腺癌、肺癌、乳腺癌等核酸疫苗也正處于研究階段。
而在動物用DNA疫苗的研究方面，與人用DNA疫苗存在著很大的差距，大多還僅僅處于實驗室的研究階段。目前，動物用DNA疫苗的研究主要還集中在對養殖業威脅嚴重的傳染性疾病上[14]，目前已開展研究并取得一定實驗室結果的病原有：禽流感病毒(AIV)、 雞新城疫病毒(NDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV)、雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)、 雞傳染性支氣管炎病毒(IBV) 、鴨乙肝病毒(DHBV)、 偽狂犬病病毒(PrV)、口蹄疫病毒(FMDV) 、豬呼吸及繁殖綜合征病毒(PRRS)、豬流感病毒(SIV) 、牛皰疹病毒(BHV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV) 、牛環形泰勒蟲、貓免疫缺陷病毒(FIV)、貓白血病病毒(FeLV) 、犬細小病毒(CPV) 、狂犬病病毒等，但是這一切從研究到田間實驗、區域試驗和批準為正式產品，似乎還有很大的一段距離。
關于DNA疫苗免疫佐劑方面的研究正在發展，已經發展起來的DNA疫苗不僅只是使用DNA，而且還包括一些附加物，它有助于DNA進入靶細胞，或者起到佐劑的作用，以增強免疫應答。
除了原有的免疫途徑如肌肉、表皮、粘膜和靜脈等組織器官外，還有新免疫途徑的發現。例如，利用減毒的細菌作為載體將DNA疫苗導入體內和直接注射到局部淋巴結或脾臟等新的接種方法均取得了較好的效果。質粒DNA的接種劑量，接種途徑及接種程序等方面的研究也將是下一步的熱點。
在２１世紀，隨著分子生物技術的不斷發展以及人們研究的不斷深入，相信DNA疫苗必將會為人類和動物的健康做出巨大貢獻，必將成為人類和動物與各種疾病抗爭的有利武器。
