盡管最常用的DNA疫苗劑形是將DNA疫苗溶于生理鹽水，直接免疫動物即可產生較好的免疫反應，但同時也有許多研究表明，聯合使用某些佐劑可以增強DNA疫苗的免疫效果，而且某些佐劑能調節免疫應答的類型。

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　　隨著研究的不斷深入，越來越多的細胞因子被人們發現和了解，迄今為止，人們已經發現了近幾十種細胞因子[51]。由于細胞因子一般比較昂貴，因此以純化細胞因子作為佐劑尚不多見，但是隨著DNA疫苗技術的出現，人們可以將攜帶細胞因子的真核表達質粒導入體內，使相應的細胞因子在體內得以表達，從而使得細胞因子作為佐劑使用得到快速發展。但是禽類細胞因子的研究遠遠落后于哺乳動物，目前僅發現了8種禽類的細胞因子，其中包括IL-1β、IL-2、IL-8、IL-15、IFN-α、IFN-γ、TGF-β4和lymphotactin [52], 因此在禽類以細胞因子作為DNA疫苗佐劑的研究還比較少。Lillehoj等[52]以雞艾美爾球蟲3-1E基因（pcDNA 3-1E）免疫為模型研究了上述8種雞細胞因子對DNA疫苗的佐劑作用。1μg IFN-γ和10μg lymphotactin表達質粒與pcDNA 3-1E聯合免疫，可顯著增強抗球蟲病的保護率。分別將10μg IL-8、lymphotactin、IFN-α、IL-15、TGF-β4、IL-1β與pcDNA 3-1E聯合免疫可明顯降低球蟲的復制，增強了免疫效率。流式細胞術檢測表明共注射IL-8或IL-15表達質粒的pcDNA 3-1E與單注射pcDNA 3-1E相比，十二指腸上皮細胞中CD3+細胞比例下降，而共注射其它細胞因子的DNA疫苗都增加了CD3+細胞比例。Vanrompay等[53]將火雞γ-干擾素基因克隆入pCI-neo載體構建成pCIneo-IFN-γ，探討了對禽類血清A型衣原體的外膜蛋白（MOMP）基因免疫的影響。結果發現共表達火雞IFN-γ組對衣原體的攻擊保護率達80%，明顯增強了免疫效果。這些結果都提示細胞因子可以作為禽類DNA疫苗的優良天然免疫佐劑。

　　在哺乳動物DNA疫苗的研究中，也廣泛使用趨化因子（如：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、TCA-3等）和共刺激因子（如：CD80、CD86、CD40等）作為免疫佐劑[50]，但是在禽類尚無類似報道。

　?。ǘ?、化學佐劑

　　在哺乳動物DNA疫苗的研究中，脂質體，免疫刺激復合物（ISCOM）、生物可降解微球(biodegradable microsphere)、磷酸鈣等都顯示出作為佐劑的良好應用前景。脂質體是一種人工合成的濃縮磷酸脂雙分子層小顆粒。作為佐劑有以下優點：生物體內可降解、無毒、免疫惰性、容易制備以及組分可以調整，能獲得很高的免疫效價。其中陽離子脂質體/DNA混合物比陰離子及中性脂質體能更為有效地轉染不同類型的組織和細胞類型，且能夠攜帶大片段DNA分子（≥250 kb）進入細胞, 但是具體機制尚不清楚[45]。ISCOM是膽固醇、磷脂及QuilA混合形成的一種穩定的籠狀復合物，其增強免疫應答的機制可能是由于其體積小，具有親水性而易于被APC吞噬[54]，由ISCOM誘導的免疫反應以Th1型為主。所謂的生物可降解性微球是指由一些在生物體內可降解的高分子聚合物組成的直徑在1-200 μm之間的顆粒，它的作用是將抗原或DNA疫苗包裹在其中，在體內隨著降解而慢慢釋放，從而誘導長期的免疫反應[55]。在禽類DNA疫苗的研究中，除了脂質體外，其它如ISCOM和生物可降解微球尚未有報道。Suarez等以帶有禽流感HA基因的pCI-neo-HA質粒為模型，比較了蔗糖、二氨基右旋糖苷、磷酸鈣、聚凝胺和兩種不同的脂質體對DNA疫苗的影響，結果發現兩種陽離子脂質體都能提高抗體水平和增強保護率, 但其他佐劑反而降低了抗體水平。Sakaguchi等以脂質體為佐劑制備新城疫病毒DNA疫苗，結果發現免疫5只雞中有4只出現了高水平的抗體，免疫后9周，攻擊NDV強毒株，結果發現產生抗NDV F蛋白抗體的免疫雞能保護致死性NDV的攻擊，而裸質粒對照組僅有2只雞出現了中和抗體，這表明，陽離子脂質體具有很強的佐劑作用。

　?。ㄈpG序列

　　在哺乳動物中，CpG基序已經被證明是一種強烈的非特異性免疫刺激劑，CpG DNA可促進機體內建立Th1型為主的免疫應答，誘導IL-12、INF-γ等細胞因子的產生。國內孟樹松等首次將富含CpG序列的細菌DNA和ILTV DNA疫苗聯合免疫SPF雞，結果發現CpG DNA 增強了胸腺、法氏囊淋巴細胞的增殖活性和血清抗體水平，攻毒后的存活率從79%提高到86%，這提示CpG序列也可作為禽類DNA疫苗的一種優良佐劑。

　　五、影響DNA疫苗免疫應答的因素

　　影響DNA疫苗應答的因素很多，比如載體本身的情況，不同的接種方式，接種劑量、宿主的差異等均可能對免疫應答的強度及免疫應答的類型造成影響。

　?。ㄒ唬?、載體本身的因素

　　對于載體本身而言，啟動子強弱是決定免疫應答強度的最主要因素，這在前面部分已經進行了討論。由于DNA疫苗載體由細菌質粒DNA衍生而來，而細菌的DNA中富含CpG基序，因此，載體序列中CpG基序的有無及數量多少也成了影響免疫應答的因素。此外，質粒的存在形式也可能會對免疫應答造成影響，例如僅有的一篇研究報道表明，將NDV F基因克隆入CMV極早期啟動子和雞β肌動蛋白基因啟動子的下游，構建NDV DNA疫苗，環狀質粒DNA肌肉接種1周齡小雞并不能誘導產生針對F蛋白的抗體，也沒有任何保護效果，而線性化質粒DNA免疫后的5只雞有4只產生了高水平的抗體，并能保護強毒株的攻擊。而在其他所有的研究中使用的都是高純度的超螺旋質粒DNA進行免疫。

　?。ǘ?、接種途徑及佐劑

　　不同的接種途徑不僅會影響DNA疫苗激發的免疫應答的強度，而且也會影響免疫應答的類型。Pertmer等研究發現，肌肉接種主要產生Th1型免疫應答，而基因槍免疫則主要產生Th2型免疫應答。使用不同的佐劑也會產生不同的免疫應答。一般認為，IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、CpG序列、ISCOM等可以使免疫應答向Th1方向發展，而IL-4、IL-6、IL-10等則可使免疫應答向Th2方向發展。此外，同時接種多種質粒時，雖然不一定改變免疫應答的強度，但是可能會使免疫應答的類型發生改變。比如小鼠皮內接種表達人流感病毒HA基因的DNA疫苗，一般產生Th1型免疫應答，而BHV-1gD編碼質粒產生Th2型應答, 當將兩種質粒同時接種時，則使針對兩種抗原的免疫應答同時向Th2方向發展。

　?。ㄈ?、免疫劑量和免疫程序

　　根據不同的接種途徑及動物的種類，不同試驗中所使用的質粒DNA的差異很大，單次接種劑量，最少的為0.25μg, 最多為750μg。在大多數研究中，免疫反應的強度都與免疫劑量呈正相關。但是，Suarez 和Schultz-cherry的試驗中，當用100μg劑量進行肌肉接種時可獲得較好的免疫效果，當用較大劑量時，免疫效果反而下降。

　　在禽類DNA免疫程序中，一般都是在1周齡以內進行首免，然后再進行1-2次增強免疫，但是大部分的研究表明，只有在加強免疫后才會取得較好的免疫效果。