（一）、安全性考慮

　　家禽及其產(chǎn)品是人類食品結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因此對(duì)于DNA疫苗的使用，必須考慮到其對(duì)禽類本身及對(duì)人類的潛在危害性。目前對(duì)DNA疫苗的安全性考慮主要基于以下四個(gè)方面：（1）質(zhì)粒DNA低水平整合到宿主基因組的潛在危險(xiǎn)性；（2）DNA疫苗載體攜帶的抗生素基因可能導(dǎo)致的生物學(xué)后果；（3）產(chǎn)生針對(duì)雙鏈DNA的抗體；（4）引起免疫耐受。

　　外源DNA隨機(jī)整合入宿主基因組，可能會(huì)激活癌基因或者使腫瘤抑制物失活。此外，外源DNA被干細(xì)胞或生殖細(xì)胞攝取之后還可能將外源DNA傳給后代。但是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA整合入基因組DNA的直接證據(jù)，僅有Schubbert等的一篇報(bào)道表明在小鼠脾細(xì)胞、肝細(xì)胞及腸細(xì)胞中檢測(cè)到降解的質(zhì)粒DNA片段。

　　一般用作DNA疫苗的真核表達(dá)載體為了篩選方便都帶有一個(gè)抗生素抗性基因，最常用的是氨芐青霉素抗性和卡那霉素抗性基因，抗生素抗性基因的存在有可能導(dǎo)致致病菌的耐藥性問題，但是如果能夠?qū)μ囟股乜剐曰虻氖褂米鞒鲆粋€(gè)通用的規(guī)定，那么這個(gè)問題也應(yīng)該可以解決。

　　到目前為止，在人和小鼠都曾經(jīng)檢測(cè)到針對(duì)dsDNA的抗體，這可能是由于長(zhǎng)期自然接觸細(xì)菌DNA引起的，而且這種抗體與哺乳動(dòng)物DNA之間沒有交叉反應(yīng)，但是人們還是不免會(huì)擔(dān)心長(zhǎng)期暴露于質(zhì)粒DNA是否會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)dsDNA的抗體，從而引發(fā)自身免疫性疾病。FDA生物學(xué)評(píng)估中心（Center for Biologics Evaluation Research, CBER）進(jìn)行的研究中，正常小鼠多次免疫之后，確實(shí)可以激活分泌針對(duì)自身DNA抗體的自身反應(yīng)性B細(xì)胞，這種自身反應(yīng)性抗體的量最大可升高4倍，但是尚不足以對(duì)正常小鼠引起任何異常反應(yīng)。另外，也沒有觀察到針對(duì)表達(dá)外源抗原的肌細(xì)胞和DC的免疫反應(yīng)。但是不同的DNA疫苗之間可能有差異（如表達(dá)不同的抗原），因此必須通過臨床前研究加以驗(yàn)證。

　　關(guān)于DNA疫苗是否能夠引發(fā)新生動(dòng)物免疫耐受的研究結(jié)果不盡一致。有研究表明，新生小鼠免疫編碼瘧原蟲環(huán)孢子體蛋白（Circumsporozoite protein, CSP）的質(zhì)粒可誘發(fā)長(zhǎng)期的免疫耐受,進(jìn)一步的研究證明，這種誘發(fā)免疫耐受的機(jī)率隨免疫劑量的增加和動(dòng)物年齡的降低而增高，且是非MHC依賴性的。但是編碼流感病毒、狂犬病毒、乙肝病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒抗原及其他瘧原蟲抗原的DNA疫苗均不能誘導(dǎo)免疫耐受。此外，在成年動(dòng)物也未觀察到由DNA疫苗引發(fā)的免疫耐受現(xiàn)象。這些都提示DNA疫苗是否誘發(fā)免疫耐受可能與編碼抗原、動(dòng)物年齡以及免疫次數(shù)有關(guān)。

　　針對(duì)上述四種潛在的危害性，美國(guó)FDA、WHO及EU都對(duì)DNA疫苗的研制制定了一些指導(dǎo)性規(guī)定[82], 為DNA疫苗的研究、生產(chǎn)及應(yīng)用指明了方向。

　　（二）、研制價(jià)格低廉、實(shí)用化的禽用DNA疫苗

　　在人的DNA疫苗應(yīng)用研究方面，已經(jīng)取得了很大的突破。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)流感、結(jié)核、瘧疾、乙肝等數(shù)種DNA疫苗做臨床應(yīng)用研究，其中結(jié)核和瘧疾的DNA疫苗已獲準(zhǔn)生產(chǎn)，我國(guó)也有10余種核酸疫苗進(jìn)入了臨床前研究。但是目前，有關(guān)禽類DNA疫苗的研究?jī)H局限于實(shí)驗(yàn)室階段，到臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的一段路要走。究其原因，主要是由于DNA疫苗代價(jià)相對(duì)較高，且不適于集約化養(yǎng)殖的群體免疫。因此開發(fā)出價(jià)格低廉、實(shí)用化的DNA疫苗是決定其是否能在家禽應(yīng)用的關(guān)鍵，大致可以從以下兩個(gè)方面來解決：

　　1、改進(jìn)DNA疫苗生產(chǎn)工藝

　　由于基因槍免疫法在家禽應(yīng)用有它的局限性，而常用的肌肉注射法又存在DNA攝取效率低，需要的免疫劑量大的缺陷，因而，尋找一種簡(jiǎn)便、高效、價(jià)廉、適合大規(guī)模制備高純度質(zhì)粒DNA的方法非常必要。在這方面，有人已經(jīng)進(jìn)行了一些探索，通過離子交換色譜法（Ion exchange chromatography）或親水相互作用色譜法（Hydrophobic interaction chromatography）[85-86]對(duì)質(zhì)粒制備方法進(jìn)行探索，取得了較好的效果，可以獲得高純度的質(zhì)粒DNA，完全可以滿足DNA疫苗對(duì)純度的要求，而且適合于規(guī)模化制備，是一種很有前景的方法。

　　2、優(yōu)化DNA疫苗的接種方式

　　DNA疫苗的接種方式不僅會(huì)影響免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和免疫應(yīng)答的類型，而且直接決定了疫苗應(yīng)用的實(shí)際可操作性，通過對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的整理分析，筆者認(rèn)為有以下幾種方式有可能得到實(shí)際應(yīng)用：

　　⑴、以減毒胞內(nèi)菌作為DNA疫苗的運(yùn)送載體：

　　利用基因工程減毒的某些侵襲性胞內(nèi)菌作為載體運(yùn)送DNA疫苗是一種新型的途徑。常用的減毒胞內(nèi)菌有鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志賀氏桿菌(Sheigella flexneri)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、侵襲性大腸桿菌(invasive E.coli)、分支桿菌(M.bovis Bacille Calmette-Guèrin, BCG)及單核細(xì)胞增生癥李斯特菌(Listeria monocytogenes)等。通過減毒胞內(nèi)菌運(yùn)送DNA疫苗的最大優(yōu)勢(shì)就在于其能夠?qū)NA疫苗直接運(yùn)送到專業(yè)性抗原提呈細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)內(nèi)，細(xì)菌在APC中裂解后，將攜帶的質(zhì)粒DNA釋放出來。其中鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌及單核細(xì)胞增生癥李斯特菌對(duì)巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的偏嗜性,而且還能夠直接向DC細(xì)胞運(yùn)送DNA疫苗,與其他單核細(xì)胞相比，DC具有更強(qiáng)的抗原提呈能力。作為細(xì)菌組成成分的LPS和未甲基化的CpG基序還可以作為佐劑增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。另外，用減毒胞內(nèi)菌作為運(yùn)送載體可以通過口服或滴鼻途徑進(jìn)行免疫，從而有利于激發(fā)粘膜免疫反應(yīng)。目前，應(yīng)用減毒胞內(nèi)菌運(yùn)送DNA疫苗的途徑已在小鼠和魚類模型中進(jìn)行了廣泛的研究，取得了一些令人振奮的結(jié)果。在禽類尚無(wú)類似報(bào)道，但是已經(jīng)有了一些比較好的減毒沙門氏菌菌株被用作弱毒苗預(yù)防禽類沙門氏菌感染或作為禽類疫苗的原核表達(dá)載體, 但是這些減毒疫苗株是否適于用作禽類DNA疫苗的運(yùn)送載體，還需要通過研究證實(shí)。

　　⑵、體表免疫

　　皮膚已經(jīng)被證明是一個(gè)重要的免疫器官, 通過體表涂布的方式進(jìn)行DNA疫苗的免疫也是近兩年剛剛興起的一種免疫方法，在小鼠及其他一些動(dòng)物模型中均取得了較好的應(yīng)用效果。因此在雞，通過該途徑進(jìn)行免疫也應(yīng)該是切實(shí)可行的。Keckert等用表達(dá)綠色熒光蛋白的表達(dá)載體與等量DMSO混合，以50μg的劑量對(duì)4周齡雞進(jìn)行翼部皮膚表面涂布，2天后在接種部位的皮膚，接種部位深層肌肉、心臟、肺和脾臟中均檢測(cè)到GFP的表達(dá)，表明免疫后質(zhì)粒DNA在體內(nèi)得到廣泛分布和功能性表達(dá)。用同樣的方法免疫編碼NDV HN基因和編碼IBDV VP2/VP4/VP3基因的表達(dá)載體，不僅檢測(cè)到全身和粘膜免疫應(yīng)答，而且產(chǎn)生了很好的免疫保護(hù)效率(均為86%)。

　　⑶、卵內(nèi)接種(in ovo immunization)

　　在過去的10年中，卵內(nèi)接種已被廣泛用于某些家禽病毒性疾病的疫苗接種。1997年Johnston等通過肌肉注射途徑對(duì)雞胚進(jìn)行DNA疫苗接種，檢測(cè)到報(bào)告基因表達(dá)。2000年Oshop等對(duì)該方法進(jìn)行了改進(jìn)，于17日齡時(shí)將編碼GFP的表達(dá)質(zhì)粒DNA用中性脂質(zhì)體包裹后與DMSO等量混合，通過雞胚氣室上打的小孔將混合物滴加到殼膜上，在肺、肌肉、脾臟等不同的組織器官中均檢測(cè)到GFP表達(dá)，將GFP基因替換為NDV的HN基因和IBDV的VP2/VP4/VP3基因后用同樣的方法免疫，通過免疫組化的方法可以檢測(cè)到病毒抗原的表達(dá)，而接種空載體作對(duì)照的雞胚未檢測(cè)到抗原表達(dá)，說明這種接種方法對(duì)DNA疫苗是有效的。

　　八、結(jié)語(yǔ)

　　大量的研究為DNA疫苗在禽病防制中的應(yīng)用展示了美好的前景。但是DNA疫苗的概念對(duì)于家禽業(yè)而言還只能算是一個(gè)雛形，還有相當(dāng)多的問題亟待人們?nèi)ソ鉀Q。比如DNA疫苗在禽類激發(fā)的免疫應(yīng)答的機(jī)制是什么，我們?cè)鯓硬拍軐?duì)免疫應(yīng)答的類型進(jìn)行調(diào)控，什么樣的接種途徑最適合規(guī)模化養(yǎng)殖家禽免疫接種的需要等等。但是歸納為一點(diǎn)，DNA疫苗要想真正進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用，必須符合這樣一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：價(jià)格低廉，易于操作，能夠產(chǎn)生足夠的免疫保護(hù)力。相信在禽病學(xué)家和免疫學(xué)家的共同努力下，最終肯定能找到一條把家禽DNA疫苗推向生產(chǎn)應(yīng)用的有效途徑。