PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術，Korana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想：“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”。

　　PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似于DNA的體內復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。

　　PCR的改進與完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫， 90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一

　　種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應后再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由于提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

　　PCR技術的基本原理

　　PCR技術的基本原理　類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

　　②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。 到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

　　PCR的反應動力學　PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期， 即出現“停滯效應” 這種效應稱平臺期數、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。

　　PCR擴增產物 　可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5"端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由于引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的DNA為模板，引物是從3"端開始延伸， 其5"端是固定的，3" 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是“長產物片段”。進入第二周期后，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即“長產物片段”)結合。引物在與新鏈結時， 由于新鏈模板的5"端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3"端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定于引物擴增序列以內、形成長短一致的“短產物片段”。不難看出“短產物片段”是按指數倍數增加， 而“長產物片段”則以算術倍數增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

　　PCR反應體系與反應條件

　　標準的PCR反應體系：

　　10×擴增緩沖液 　10ul

　　4種dNTP混合物 　各200umol/L

　　引物 　各10～100pmol　

　　模板DNA 　　0.1～2ug　

　　Taq DNA聚合酶 　2.5u　

　　Mg2+ 1.5mmol/L

　　加雙或三蒸水至 　100ul

　　PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

　　引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

　　設計引物應遵循以下原則：

　　①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

　　②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

　　③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。

　　ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

　　④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3"端的互補，否則會形成引

　　物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

　　⑤引物3"端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基

　　不配對而導致PCR失敗。

　　⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶

　　切分析或分子克隆很有好處。

　　⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物

　　的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會

　　引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

　　酶及其濃度　目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然

　　酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

　　dNTP的質量與濃度　dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

　　Mg2+濃度　Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

　　PCR反應條件的選擇

　　PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

　　溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準

　　反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

　　①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

　　②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

　　復性溫度=Tm值-(5～10℃)

　　在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，

　　提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

　　③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　高于90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

　　PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

　　循環次數循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

　　PCR反應特點

　　特異性強：PCR反應的特異性決定因素為：

　　①引物與模板DNA特異正確的結合；

　　②堿基配對原則；

　　③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

　　④靶基因的特異性與保守性。

　　其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配

　　對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能

　　保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

　　靈敏度高： PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10- 12)量級的起始

　　待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中

　　，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

　　簡便、快速： PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

　　對標本的純度要求低： 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗制

　　的DNA擴增檢測。

　　PCR擴增產物的分析

　　PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否準確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定

　　，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而采用不同的分析方法。

　　凝膠電泳分析

　　PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

　　瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠， 供檢測用。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比

　　較集中，可用于科研及檢測分析。

　　酶切分析： 根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得

　　符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

　　分子雜交： 分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物堿基突變的有效方法。

　　Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記

　　后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，

　　還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

　　斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針

　　雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。

　　核酸序列分析： 是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。

　　PCR產物克隆方法

　　平端連接

　　通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3"末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3"突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產物的效率通過較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3"末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。

　　粘端連接

　　引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5"末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5"末端設計單限制酶或雙限制酶切位點。這樣得到的PCR產物用限制酶消化產生粘性末端，即可與有互補粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當兩引物中設計不同酶切位點時，可有效地定向克隆PCR產物。其缺點是需要加長PCR引物，除限制酶識別序列外，還需要在其5"端多合成3-4個堿基以利于限制性內切酶與PCR產物末端的穩定結合

　　。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數個核苷酸創造出一個限制性內切酶位點。鑒于PCR引物的3"末端序列的互補性是PCR成功的關鍵，在PCR引物的中部或近5"端改變1個或幾個堿基對PCR擴增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長度，而且酶切效果優于5"加端法。對于特定DNA片段的克隆，此方法較為經濟、實用。但對于基因診斷PCR產物的克隆，似乎5"加端法更為適宜。

　　T4DNA聚合回切產生粘端：如PCR兩引物的5"末端是A或T，則可在其5"端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴增的PCR產物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進行處理，則T4DNA聚合酶因具有3"→5"外切酶活性而消去3"末端的G和C，產生AccI和XmaI粘性末端（圖1）。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進行連接。這種方法只需在PCR引物的5"端加2-4個堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

　　T－vector法

　　TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3"末端加一個堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據此，Marchuk等人采用3"端突出一個胸苷的質粒DNA來克隆PCR產物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個3"末端各加一處胸苷。因

　　為在4種dNTP都存在時，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當僅一種dNTP存在時，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉變成3"末端突出一個胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產物。Hotton等人也報道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉移酶在切成平端的載體DNA的3"末端加上一個胸苷。由于末端轉移酶可以催化多個堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個3"末端各加上一個T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3"末端不能與待克隆PCR產物的5"末端連接，僅5"末端可與PCR產物的3"末端形成磷酸二脂鍵。

　　共環消解法

　　最近，Jung等人報道了一種有效的PCR產物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴增得到的PCR產物，先用T4DNA連接酶催化連接反應，使5"端帶有限制酶切位點的擴增DNA片段連接成共環結構。然后再用相應的限制酶進行消化，產生粘端DNA片段。對于對稱性限制酶位點，只需在引蛾的5"末端加上一關識別序列，因為在串接成共環后能恢復限制酶切位點難于切開的缺點，且可用于雙限制酶切位點的設計，只不過有PCR產物共環化后，僅約1/4的限制酶切點得以恢復。故此法較適用于單限制酶位點的克隆。

　　無連接酶亞克隆法(A)無連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物

　　5"末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點，而是與某一質粒兩端分別互補的堿基。

　　兩引物的3"端約20-25個核苷酸分別與待擴增DNA兩翼互補，5"端各有約24個核苷酸分別與線性化質粒的3"端相同的附加序列。由于線性化質粒的3"端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5"附加序列與引物3"端定向雜交。

　　由此物a和b產生的兩端有附加序列的PCR產物與未反應引物分離后，分別加入兩只含有線性化質粒的反應管中進行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5"端附加序列內測的質粒（+）鏈互補。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5"附加序列內側的質粒（-）鏈互補。

　　第二次PCR的第一循環中，PCR產物與質粒均變性與復性。除自身復性產物（這種復性產物不被擴增）外，PCR產物與質粒可通過各自3"端互補序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時，重疊的3"端互為此物沿各自互補鏈延伸，結果可產生PCR片段與線性質粒的"連接"。然后兩管中PCR擴增各進行15-20個循環。這便可產生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質粒。 第二次PCR后將第1管與第2管反應液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應管中的單鏈DNA可以復性或幾種不同的產物，除各自本身復性產物外，管1產物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長的5"或3"懸端，這種長的5"或3"懸端相互互補，在低DNA濃度時可復性產生環化DNA。

　　盡管這種環化的DNA有兩個缺口，但它們可以直接用來轉化受體大腸直桿菌。一旦進入體內，兩個缺口便共價連接，修復的質粒即可復制，下面以從λ噬菌體DNA中擴增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

　　這種方法同樣適于復雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時兩引物的5"附加序列不應太短以免影響第二次PCR時異源雙鏈的形成，以24個核苷酸較為合適。擴增時若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會嚴重影響轉化率。用LFS法已成功地克隆了長達1.7kb的基因片段。這種方法的優點是：①可用于常規方法無法進行亞克隆的片段；②適于任何PCR產物和任何質粒；③可亞克隆特殊目的（如含點突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對已構建了啟動子或增強子等序列的載體，可使待表達片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內完成，較常規方法可靠，不需DNA連接酶。

　　DNA克隆是分子生物學的重要內容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時間，比之全基因合成更為經濟和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產物的異性問題和分型問題，采用產物克隆和測序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準確。隨著PCR技術的不斷發展和推廣，新的PCR產物的克隆方法也將不斷出現。

　　PCR基礎的檢測工具的優缺點

　　首先，PCR反應是快速的。整個DNA提取，擴增和檢測的過程通常少于6小時，如果反應利用嵌套的引物，過程可能長些。對于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長了整個檢測的時間到14小時。

　　用購買的核苷酸提取工具就能縮短檢測時間，機械進行提取，使PCR方案最優化或使用加快熱循環技術。有了優化的樣本，快速提取和光循環熱循環，整個檢測時間能縮短到2小時。但通常是6-8小時。

　　于培養基基礎的方法2-5天的時間相比較，這是巨大的進展了。這也比一些需要有精確

　　計算結果的培養基濃縮的抗體檢測實驗要快。當購買的實用抗體基礎的檢測工具比PCR基礎的方法快時，大部分這樣的化驗只能用于非常有限的生物體上。

　　第二，PCR不需要培養。這是與PCR基礎的檢測的速度密切相關的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測），培養通常是沒必要的。大多數最新的實用PCR檢測工具需要有選擇性的濃縮，特別是當樣本包括大量的PCR抑制劑時。用核苷酸提取方法能夠避免培養，核苷酸提取方法產生了PCR質量的DNA并且優化了PCR反應。如果在大量樣本中檢測少量的病原體或者病源有機體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養。在一般情況下，使用培養的情況是很少的，去除了培養的步驟，時間將被節省下來。

　　比節省時間更重要的是，去除了培養，那些難以或不能培養的生物體就可以進行檢測

　　。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

　　第三，PCR的花費合理。與培養或抗體基礎的化驗相比，PCR基礎的診斷是十分經濟的。

　　考慮到細菌的培養，有較昂貴的花費。大多數樣本為了正確的鑒定需要培養和重復培

　　養。這需要大量的手工時間（加上化驗的花費），也增加了污染的危險。

　　作為比較，大多數抗體化驗所需的手工時間很少但化驗本身很昂貴。

　　PCR反應的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費比每次化驗的花費少40%，而反應的時間包括核苷酸分離，通常在一小時以內。當然這依賴于樣本、技術員和用于分離核苷酸的技術。既然PCR所用的時間少，它的花費也少。

　　但是，PCR需要熱循環，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實驗室的最初花費是很高的。

　　這里討論了另外一些在臨床領域的PCR使用的基本原理

　　第一， PCR不是抗原基礎的。

　　抗體基礎的檢測工具（ELISA和其他）不僅檢測1）直接抗病原體的人類抗體，而且能

　　檢測2）病原體上的表面抗原。人類抗體檢測工具因此需要免疫反應的存在，以及在正確檢

　　測抗原存在之前抗體濃度的測定。在新近感染的情況下，這種測試不能檢測針對病原體的

　　人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實上，被感染的病人，沒有充足的時間來提

　　高用于檢測的濃度。這是HIV抗體基礎檢測的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測試對檢測無免疫應答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎的測試也會給出錯誤相

　　反的結果。

　　然而抗體基礎的檢測最大的問題是它不能檢測新的病原體亞型，由于表面抗原發生改

　　變，而導致了錯誤的陰性結果。（PCR基礎的檢驗也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎的檢驗能夠進行設計，使這些錯誤的陰性結果最小化。）

　　盡管有這些缺點，抗原基礎的檢測工具是十分重要的檢測方法，在大多數情況下比PC

　　R檢測要迅速。

　　第二， 檢驗易按客戶的要求設置，以適合特殊的需要

　　通過簡單使用不同的特殊目標引物，工具能迅速設計，用于許多檢測。

　　第三， PCR容易使用，是由時間證實的技術

　　通過使用有商業價值的核苷酸提取產物，用于病原體檢測的樣本能在少于十分鐘的時

　　間內被例行操作。一旦進行操作，樣本被加入反應體系中，進入熱循環。反應完成后，樣

　　本能被自動系統或凝膠電泳所分析。

　　少數的PCR檢測將能完全自動化。儀器將進行所有操作，從樣品的準備到分析結果。這樣的系統將十分昂貴，可能只能適應制造商的平臺。這對大多數臨床實驗室無吸引力，但當價格下降后，將最終使PCR診斷自動化。