斷奶仔豬腹瀉（post-weaning diarrhea，PWD）和豬水腫病（porcine edema disease，ED）是兩種導致仔豬死亡的重要傳染性疾病，目前已成為養豬業有重要意義的疾病。ED和PWD常發生于同一個豬群，并且病原菌的毒力因子也有相同之處，都是由具有某種粘附因子并能產生一種或多種外毒素的大腸桿菌菌株引起,這些粘附因子可使大腸桿菌定殖于小腸。它們大多屬于有限的幾種血清型。在一給定的區域內，血清型與一套相當恒定的粘附因子和毒素緊密相關。引起PWD 和ED的大腸桿菌主要產生F4（K88）和F18兩類粘附素，同時也可產生類志賀毒素2變異體（Stx 2e）。

　　ED是仔豬一種較常見的傳染病，主要發生于斷奶一周左右的仔豬，是由產vero細胞毒素大腸桿菌引起的傳染性腸毒血癥，其O血清型主要為 O139，其次為O138和O141。病豬常出現一系列的神經癥狀，如共濟失調，驚厥和后肢癱瘓等典型癥狀；死亡剖解可見皮下組織、腸系膜、胃大彎粘膜下層水腫等。該病發病率較低，但死亡率可高達90%以上，給養豬業造成了相當大的經濟損失。隨著近幾十年的深入研究，人們對水腫病的致病機理有了比較詳細的了解，明確了豬水腫病的發生與大腸桿菌的兩個主要毒力因子：F107（現稱F18ab）菌毛及類志賀毒素2變異體（Stx 2e）密切相關。PWD常發生于斷奶后至12周齡，特別在斷奶后14天內易發。PWD也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因之一，死亡高峰通常在4-10周齡。PWD主要特征為患病仔豬拉淡黃或灰白稀糞，常持續1周或1周以上，仔豬逐漸消瘦，脫水，精神沉郁，食欲減退，被毛粗亂，部分仔豬死亡。引起斷奶仔豬腹瀉的大腸桿菌國內幾乎沒有報道。國外報道的血清型主要有O149，O8，O138，O139，O141，O147，O157等。其致病性主要與該類細菌表面菌毛F4或F18ac及此類菌株產生的Stx 2e有關。引起ED和PWD的大腸桿菌的發病機理是一致的：仔豬斷奶后，由于斷奶應激，體內母源抗體的逐漸消失，消化道內環境的改變，以及飼養管理、營養條件、環境因素的忽然改變，導致機體的抵抗力下降，當易感仔豬感染病原性菌后，細菌通過其自身的菌毛附著于小腸絨毛上，從而在小腸內定居，并開始大量生長和繁殖，在這過程中產生毒素并被吸收，從而引起一系列臨床癥狀并導致仔豬死亡。在丹麥，（Ojeniyi 等1994，Ripying等，1995）28至49日齡斷奶仔豬腹瀉樣品中分離到的184株致病性大腸桿菌中，F18和F4分別占44%和36%；在德國， Wittig等從PWD和ED病例中分離到的380株大腸桿菌中F18ab和F18ac分別占40%和35%，F4占14%。PWD和ED都是由毒素引起的，從致死病例中分離到的大腸桿菌幾乎全部為產毒素型（Imberechts等，1994；Wittig等1995）。Osek等（2000）從波蘭致PWD病例中所分離到的46株大腸桿菌中有34株（73.9%）可產生Stx 2e；Imberechts等（1992）用PCR技術對28個致ED大腸桿菌標準株和分離株進行了F18主要亞單位A的結構基因fedA和stx2e基因的檢測，結果fedA 陽性者24株（占85.7%），其中的20株（83.3%）同時含有stx 2e基因。Osek等利用PCR方法對fedA基因進行檢測，發生61.9%的致斷奶仔豬腹瀉分離株以及84.2%的致豬水腫病分離株都含有fedA基因。鑒于F4、F18粘附素在致PWD和ED大腸桿菌中的高出現率及與Stx 2e間較高的相關性，可以認定F4、F18和Stx 2e是上述大腸桿菌的的主要致病因子。

　　除流行病學調查之外，國外在PWD和ED的致病、免疫機理方面也有部分報道。Imberechts等（1992）以F18ab基因轉化大腸桿菌HB101，形成了可吸附于豬腸道上皮細胞的菌毛，而構建的FedA閱讀框無意義突變株則喪失了菌毛表達和對豬上皮細胞吸附的餓能力；Macleod等（1991）以純化的Stx 2e在SPF豬復制出了水腫病，同時，以Stx 2e主動、被動免疫的SPF豬在攻毒后均得到了保護；Jackson等（1990）進一步的研究表明，Stx 2e B亞單位的N-末端附近的親水區與毒素的結合作用有關。這些結果進一步證明了F18粘附素和Stx 2e在PWD和ED的發生中起著決定性的作用。

　　一、F18菌毛

　　 引起豬水腫病的大腸桿菌在腸道中的定居通常依賴于F18菌毛。F18ab菌毛是Bertchinger等在研究兩株致豬水腫病的大腸桿菌（O139：K12：H）菌株107/86及124/16中發現的一種新型粘附素菌毛，在體內和體外均可介導大腸桿菌吸附于易感斷奶仔豬小腸上皮且吸附作用不被甘露糖所抑制，其抗原性與已知其它粘附素K88、K99、987P和F4不同，這種菌毛被命名為F107；該菌毛不凝集包括豚鼠在內的多種動物的紅細胞，在普通培養基上不表達或根本不表達，電鏡觀察顯示該菌毛較長而易彎曲，直徑為4.6nm。血清學檢查和分子雜交的結果顯示，分離自水腫病豬大腸桿菌的血清型為O138、O139、O141、O147、O157、O16和O108具有溶血性的菌株大部分可表達F107菌毛。Nagy等在匈牙利從腹瀉的斷奶仔豬的糞便中分離到一些血清型為O141，O157大腸桿菌菌株，發現其表面粘附素不同于其他已知的任何一種粘附素，命名為2134P，直徑為3.5nm，菌毛化的細菌在體內體外都能粘附于3周齡而不是新生仔豬的小腸絨毛。利用多抗和單抗同時檢測F107、2134P菌毛，表明兩者有部分相同的抗原決定簇，Witting等將之命名為“a”，而將在F107/86和2134P菌株上各有特異的決定簇分別命名“b”和“c”。免疫電鏡試驗表明“a”和“b”或“a”和“c”沿同一菌毛分布；分別針對共同的抗原決定簇“a”和特異性抗原決定簇“b”或“c”的抗血清在免疫印跡試驗中均可識別分子量約為15kD的蛋白條帶[12]。Salejka等[13]報道在血清型O25、O45、O108、O141、O147和O157產腸毒素大腸桿菌上發現一種新型定居因子8813菌毛。8813菌毛無血凝性，在體外能凝集離體豬的腸上皮刷狀緣。后經證實8813菌毛與2134P菌毛屬同一類型，哥本哈根的國際大腸桿菌研究中心將這一系列相似的菌毛命名為F18菌毛，F107菌毛命名為F18ab菌毛，與仔豬水腫病有關；而將2134P菌毛、8813菌毛命名為F18ac菌毛，與斷奶仔豬腹瀉有關。現已明確編碼F107的基因位于大腸桿菌染色體6上，并且已經被克隆。F107菌毛由多個亞單位組成，目前已鑒定亞單位由A、E、F等。其中A亞單位（FedA）是菌毛的主要結構亞單位，亞單位E、F編碼基因其編碼基因fedE和fedF位于fedA基因的下游。Smeds等（2001）利用融合蛋白對F18菌毛粘附特征作了進一步研究表明，純化的fedF的基因融合蛋白（MBP-FedF）可粘附于離體豬腸上皮細胞，其抗血清則可阻斷質粒pIH120轉化菌HB101對離體豬場微絨毛的吸附作用。而純化的fedC和fedE的基因融合蛋白及其抗血清卻沒有這些作用。表明fedF的基因編碼菌毛粘附素。在fedA基因和fedE基因之間存在兩個有部分重疊的開放閱讀框，分別命名為fedB基因和fedC基因，兩者都有一個分泌跨膜蛋白的前導信號肽和一個在第23和第24個氨基酸間的信號肽酶酶切位點。編碼蛋白分子量分別為86.001kD和23.418kD。fedB基因、fedC基因和fedE的基因的作用尚在研究之中。 FedA亞單位的編碼基因fedA為一個具有170氨基酸的開放閱讀框（ORF），起始于160位的CTG密碼子。在這個ORF中，含有一個由21個氨基酸組成的信號肽，編碼序列于160-222bp位置，不包括信號肽，fedA氨基酸序列的分子量大約15099D。2134菌毛分子量為17kD，F18ac菌毛的編碼基因尚未明確，但純化的2134P顯示的氨基酸成分與F107菌毛有區別，但兩者氨基酸N-末端部分由很高的同源性（25/27-92.5%）。蘆銀華等通過對F18ab和F18ac兩種菌毛A亞單位基因（fedA）的克隆和序列測定比較，發現F18ab與F18 ac的fedA基因的核苷酸序列同源性為97.6%，氨基酸的同源性為94.7%，同時F18ac的fedA基因與F18ab的fedA基因相比，核苷酸序列的下游第363bp處多出了CCG3個核苷酸，并由此出現了一個新的酶切位點NgoⅠ（CGGCCG），核苷酸的變化可能引起相應氨基酸的改變，因此，可以推測F18ab與F18ac的抗源性的差異可能就是由此引起。

　　二、F4（K88）菌毛

　　 1961年φrskov等首先發現了致病性大腸桿菌的第一種菌毛具有粘附特性的K88菌毛，該菌毛不耐熱，故當時歸類于不耐熱莢膜抗原K88（L）。后來確認其本質為蛋白質粘附素，是甘露糖抗性菌毛（MRHA）。在φrskov（1983）等建立的分類和命名體系中確定為F4。F4在TSA培養基37℃有氧環境下能很好表達菌毛，而在18℃培養時不表達菌毛。F4菌毛的直徑約為2.1nm，電鏡下菌毛為絲狀、柔毛樣結構，分布菌體表面。利用特異性抗血清φrskov等將F4區分為F4ab和F4ac兩種血清型，后來又出現了一種新的血清型F4ad。F4菌毛結合仔豬小腸上皮刷狀緣的受體有三種，即腸粘液型唾液酸糖蛋白（IMTGP），腸中性鞘糖脂（IGLad）和運鐵蛋白的糖蛋白（GP74）。已發現仔豬的刷狀緣細胞的遺傳表型不同，對F4的三個變異血清型（F4ab、F4ac、F4ad）的粘附抵抗力也有差異。對F4+菌易感的仔豬表型為“粘附型”（表示F4+菌能粘附其刷狀緣），反之為“非粘附型”。這兩種表型受同一位點上的一對等位基因控制，其遺傳服從孟德爾規律。三種變異血清型都有一個共同的抗原決定簇“a”。F4血清型的變異有兩種解釋：一是因為臨床上F4+滅活疫苗及減毒疫苗的廣泛使用給細菌造成了巨大的免疫壓力，從而使其發生了變異；二是豬腸道上皮細胞上的受體發生了改變，這種解釋與Bijlsma等發現的不同F4血清型有各自不同的結合位點現象一致。但近幾年從感染發病豬中分離到的F4均為F4ac或F4ab，Fab有逐漸消失的趨勢。在韓國，Chang Sun Cho等[18]對812株腹瀉豬中分離到的大腸桿菌以PCR方法進行了鑒定發現96%為F4ac，2%為F4ab。不同分離株的F4菌毛在SDS-PAGE中呈現一條帶，其近似分子量為23.5~26kD，不同血清型，其分子量也不同。F4菌毛雖然由上百種蛋白亞單位組成，但不同血清型之間的氨基酸序列卻相差甚微。與F4菌毛生物合成有關的基因簇可包括10個（faeG~faeJ），如圖所示。除了faeA和faeB是兩個調節基因外，其余8個基因（faeC~faeJ）都是F4菌產生所需的結構基因，且分別用一個信號肽序列合成各自的多肽產物。faeG編碼的FaeG是菌毛的主要亞單位蛋白，與菌毛的粘附特性有光。faeD編碼的FaeD蛋白是一種外膜蛋白，與菌毛亞單位的轉運有關。FaeE編碼的FaeE蛋白是一種周質伴侶蛋白，其余faeC、faeF、faeH、faeI和faeJ分別編碼的五種多肽，都是菌毛結構的次要成份。

　　據Huisman等（1994，1995）的研究報道，在fae（K88）操縱子上存在一個背馳轉錄的調節基因（divergently tranciribed regulatory gene），fedA和fedB，并被二個反向的IS插入分隔。FedA是一個負調節基因，dB是正調節基因。前者的負調控作用是通過FedA和亮氨酸效應調節蛋白（leucine-resposive regulatory protein Lrp）對fae調節區的協同結合活性來實現的。后又發現，這種負調控還依賴于fae調節區內的三個GATC位點（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的甲基化狀態。GATC位點Ⅰ的甲基化可防止Lrp/FaeA 在該位點的結合，GATCⅡ位點和Ⅲ位點的甲基化會降低Lrp/FaeA結合的穩定性，但GATC位點Ⅲ的甲基化能刺激faeB啟動子的活性。據推測，二個IS插入的存在能消除Lrp/FaeA對K88生物合成的部分抑制作用。另外K88ab的重組質粒表達K88ab時，主要靠PBR322的P啟動子。在K88ab的操縱子的faeC與faeD之間有一個二重對稱區，但其mRNA的莖-環結構不太穩定。K88ab的主要亞單位在該二重對稱區的下游，所以莖-環結構不太可能起到終止作用，而是由FaeD的起始密碼來完成。不過，這種莖-環結構可能起著rho依賴性終止子的作用。同時，還含有FaeD多肽的起始位點，與K88ab菌毛的溫度依賴性合成有關。在低溫狀態下，桿狀結構趨于穩定，阻止了faeD基因轉譯的起始。

　　三、類志賀毒素2型變異體（Stx 2e）

　　1950年Timoney等將發生水腫病的腸道內容物離心后的上清靜脈注仔豬可復制出水腫病，因而證實了水腫病不是由細菌直接引起的，而是其產生的一種毒性物質引起的，這種毒性物質存在于患病豬的腸道中。1974年Nielsen和Clugston首次純化和證實了該毒素是一種蛋白質，對熱敏感，并可復制出典型的神經癥狀和動脈損傷。Macleod和Gyles（1990年）建立了一種毒素純化的最佳方案，并證實了毒素是由兩個分子量不同的亞單位組成（35kD和7.5kD），對Vero細胞具有毒性，可致死小鼠，能完全復制出仔豬水腫病。Dobrescu等研究發現該毒素和人源大腸桿菌菌株產生的Vero細胞毒素密切相關，而又有所區別，因而將其列為類志賀樣毒素家族。通過與志賀氏菌Ⅰ型毒素的抗原交叉反應確定的兩種主要類型的類志賀樣毒素，即類志賀樣毒素1型（StxⅠ）和類志賀樣毒素2型（StxⅡ類志賀樣毒素），StxⅠ和StxⅡ對Vero細胞和Hela細胞都具有毒性，而水腫病毒素對Vero細胞有較強的毒性作用而對Hela細胞較弱，而且水腫因子比StxⅠ和StxⅡ更不耐熱，它不能被StxⅠ的抗血清中。由于該毒素能被StxⅡ的抗血清中和，因而水腫病毒素被命名為類志賀樣毒素Ⅱ型變異體（Stx 2e），它同時具有細胞毒性和神經毒性。Stx 2e的基因目前已被克隆并測序，Stx 2e操縱子全長為1980bp，它由兩個亞單位基因組成—stx 2eA和stx 2eB。stx 2eA位于242bp到1199bp核苷酸之間，其中242bp到307bp核苷酸片段為前導序列；stx 2eB位于1214bp到1474bp之間，1214bp到1270bp核苷酸片段為前導序列。在stx 2eA和stx 2eB之間為一個15核苷酸的非翻譯區。兩個RBS分別位于第228bp位核苷酸處和1203bp位的核苷酸處，分別控制Stx 2e A和Stx 2e B 的翻譯。Stx 2e的核苷酸序列與志賀氏菌毒素StxⅠ和StxⅡ的比較結果顯示：Stx 2e與StxⅡ之間有很高的同源性，stx 2e A與stx 2A的同源性可達95%，stx 2eB與stx 2eB同源性可達79%。Stx 2e和類志賀毒素結構組成相似，都是由一個分子A亞單位和五個分子B亞單位的聚合體，如圖3所示。A亞單位包括297個氨基酸，分子量為33.050kD，是Stx 2e的主要毒力亞單位，是毒素的酶活性部位，它具有細胞毒性作用，可終止真核細胞的蛋白合成。A亞單位的空間結構影響其毒力和酶促活性；B亞單位由68個氨基酸組成，分子量為7.566kD，通過定點突變表明對vero細胞受體發揮作用的氨基酸位于Stx 2e B處。其不具有酶活性作用，但具有免疫原性。Stx 2e B可識別腸上皮細胞上的特異性受體并與之相結合，從而使Stx 2e可以通過“脂流”進入細胞內。受體的化學本質已經明確。其特異性受體為球狀三酰基（神經）鞘氨酸（Gb3）、球狀四酰基（神經）鞘氨酸（Gb4）和半乳糖紅細胞糖苷酶（Fb5），但Stx 2e B與Gb3結合較弱，而與Gb4和Fb5結合力較強。Gb3是空腸和Hela細胞上的主要受體，而Gb4主要存在于豬小腸上皮細胞及vero細胞上，Fb5只發現于vero細胞，這一點也就解釋了為什么Stx 2e對vero細胞有較強的毒性作用，而對Hela細胞的毒性較弱的現象。Waddell等研究表明在豬體肝臟、結腸、回腸、小腦、腦脊髓等部位可結合Stx 2e，利用單克隆抗體進一步證實Stx 2e主要結合于這些器官組織的上皮細胞和血管平滑肌細胞上。已經證明Stx 2e可阻遏豬主動脈內皮細胞的蛋白質的合成，這也說明內皮組織具有Stx 2e的特異性受體。

　　目前，ED是我國養豬業的大敵之一，每年給我國養豬業帶來的經濟損失不可低估。除ED外，由于PWD在我國的研究尚屬空白，其對我國養豬業造成的經濟損失更難估計。可以設想，PWD、ED對我國養豬業帶來的損失是不可忽視的。

　　目前，在PWD和ED的預防方面，國外以Stx2e抗毒素被動免疫和用其類毒素作主動免疫后攻毒，取得了令人滿意的免疫效果。近幾年有學者用提純的F18菌毛免疫母雞，制得針對F18的卵黃抗體，在體外能抑制F18菌株對豬腸粘膜的吸附，在體內則可對攻毒提供保護。斷奶前給仔豬經口接種大腸桿菌，據Fahy等（1992）報道可提供對PWD的部分保護力。Turnes等（1999）用含有F4主要亞單位FaeG的結構基因fedG的重組質粒免疫實驗小鼠和實驗豬，在兩者體內均誘導產生了較高的抗體水平。但至今為止，在臨床上還沒有普遍有效的預防措施，因為PWD和ED在連續幾批斷奶仔豬和同步斷奶仔豬發生的不可預見性，預防措施的效果難以評價。選育有抵抗力的豬從長遠來看是，這種方法最有效也是最經濟的。但還沒有用于確定活豬基因型的方法，選育工作還行不通。因此，研制出一種能同時誘導機體產生粘膜免疫、體液免疫的基因工程活疫苗，無疑具有重要意義。