微衛(wèi)星標(biāo)記作為繼RFLP之后的第二代分子標(biāo)記，越來越受到研究者的青睞。本文就其特征、優(yōu)點(diǎn)及在家畜遺傳育種中的應(yīng)用作一綜述。 自20世紀(jì)70年代以來，人們就已經(jīng)知道了真核生物基因組中微衛(wèi)星的存在，然而直到1982年Hamada等人在酵母至脊椎動物中均發(fā)現(xiàn)poly（dT-dG）n核心序列的多拷貝之后，人們對微衛(wèi)星數(shù)量之多、分布之廣才有了深入了解。近年來，隨著PCR技術(shù)及凝膠檢測方法的不斷發(fā)展與更新，微衛(wèi)星標(biāo)記越來越受到研究者的青睞，并發(fā)展成為繼RFLP之后的第二代分子標(biāo)記。 經(jīng)典的家畜遺傳育種研究中的形態(tài)性狀標(biāo)記因其自身固有的一些特點(diǎn)而在某種程度上已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代遺傳育種研究的需要，而分子標(biāo)記的涌現(xiàn)則為家畜遺傳育種研究帶來了新的契機(jī)。近年來，微衛(wèi)星標(biāo)記以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于家畜遺傳育種研究的各個(gè)領(lǐng)域。本文就微衛(wèi)星標(biāo)記的特征、優(yōu)點(diǎn)及其在家畜遺傳育種中的應(yīng)用作一介紹。 1．微衛(wèi)星標(biāo)記的特征及其產(chǎn)生機(jī)理 微衛(wèi)星，又稱簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR），是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（1～10個(gè)，多數(shù)為2～4個(gè)）為單位多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。微衛(wèi)星標(biāo)記由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列構(gòu)成。保守的側(cè)翼序列使微衛(wèi)星特異地定位于染色體某一區(qū)域，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。 根據(jù)微衛(wèi)星的結(jié)構(gòu)，Weber 等將其分為三類，即完全的（Perfect）、不完全的（Imperfect）和復(fù)合的（Compound）微衛(wèi)星。完全的微衛(wèi)星是指由不中斷的重復(fù)單位構(gòu)成的微衛(wèi)星；不完全的微衛(wèi)星其重復(fù)序列中間有3個(gè)以下的非重復(fù)堿基，兩側(cè)不中斷的部分重復(fù)數(shù)大于3；復(fù)合的微衛(wèi)星則指兩類或兩類以上的串聯(lián)重復(fù)單位由3個(gè)連續(xù)的非重復(fù)堿基分隔開，但不中斷的重復(fù)單位的重復(fù)數(shù)不小于5。 關(guān)于微衛(wèi)星的產(chǎn)生機(jī)制，普遍認(rèn)為是DNA復(fù)制過程中滑動，或DNA復(fù)制和修復(fù)時(shí)滑動鏈與互補(bǔ)鏈堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致一個(gè)或幾個(gè)重復(fù)單位的插入或缺失。Valdas等認(rèn)為從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度看，微衛(wèi)星的產(chǎn)生采用的是逐步突變模式（Stepwise mutation model，SSM），即每一次突變均增加一個(gè)或數(shù)個(gè)重復(fù)單位，從而導(dǎo)致一個(gè)新的等位基因的出現(xiàn)。微衛(wèi)星的功能目前尚不甚明了，但已發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星能參與遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，基因調(diào)控及細(xì)胞分化等過程，有自身特異性結(jié)合蛋白，還能直接編碼蛋白質(zhì)，是一種非常活躍的堿基序列。 2．微衛(wèi)星標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn) 2.1 分布廣泛 微衛(wèi)星廣泛分布于真核生物基因組中，不僅存在于內(nèi)含子或非編碼區(qū)，也存在于編碼區(qū)及染色體上的其它任一區(qū)域，大約每隔10～50kb就存在一個(gè)微衛(wèi)星。例如，豬基因組中存在著約65,000～100,000拷貝的二核苷酸重復(fù)單位AC/TG，平均每隔30～50kb就有一個(gè)。 2.2 高度多態(tài)，突變率低 在不同的個(gè)體中，微衛(wèi)星重復(fù)單位數(shù)目的變異非常大，由此而造成了高度的長度多態(tài)性，并使其具有較高的信息。Dallas與Edwards等估計(jì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的突變率在10－4～5×10－6之間。因此，微衛(wèi)星具有較高的多態(tài)性但其突變率卻低于10－4，這在二者之間便有了一個(gè)很好的平衡。 2.3 等位基因與基因型檢測方法簡便 一個(gè)高度多態(tài)序列的等位基因小于500bp并且變動范圍窄，則可以用PCR結(jié)合凝膠電泳法檢測，因而微衛(wèi)星序列就很好地符合了上述標(biāo)準(zhǔn)。微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增所需樣本量極少，并且由于微衛(wèi)星序列較短，即使降解的DNA也可能包含足夠用來擴(kuò)增的微衛(wèi)星序列。隨著高效精確的基因分型自動化技術(shù)的發(fā)展，微衛(wèi)星基因型檢測將會更加快捷方便。 2.4 共顯性標(biāo)記 微衛(wèi)星標(biāo)記遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好地區(qū)分純合子與雜合子。 2.5 微衛(wèi)星引物的通用性 微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性以及物種間某些染色體區(qū)段的共線性，使得從一個(gè)物種獲得的引物可以應(yīng)用于相關(guān)的分類群。如de Gortari等從牛的1036個(gè)微衛(wèi)星引物中篩選出605個(gè)可在綿羊基因組中擴(kuò)增，同源率約為58%。隨著一些物種已克隆微衛(wèi)星數(shù)目的增加，今后可望無須在另一些物種中重新克隆微衛(wèi)星，這樣將會節(jié)省大量的人力物力。 2.6 中性標(biāo)記 在多數(shù)情況下，微衛(wèi)星標(biāo)記沒有任何表型效應(yīng)，因而不存在對家畜個(gè)體的有害或次級效應(yīng)。 3．微衛(wèi)星標(biāo)記在家畜遺傳育種研究中的應(yīng)用 3.1 遺傳圖譜構(gòu)建 微衛(wèi)星因其上述特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)而成為目前構(gòu)建完整遺傳連鎖圖譜時(shí)的首選標(biāo)記。基本思路是，以微衛(wèi)星為基礎(chǔ)，在基因組中每隔一定距離找一個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記，當(dāng)這些標(biāo)記達(dá)到一定飽和度時(shí)（平均間隔不大于20cM并覆蓋90%以上基因組），便可據(jù)此繪制出一個(gè)基本的遺傳圖譜。主要家畜如牛、綿羊、豬等的連鎖圖譜已建成，并且飽和度日趨增大。圖譜上的標(biāo)記以微衛(wèi)星為主，也散在有少量的RFLP、RAPD及I型標(biāo)記。 牛的第一張微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳連鎖圖譜由Barendse于1994年建成，至此已經(jīng)又有幾個(gè)不同版本的牛遺傳連鎖圖譜繪制出。Kappes等發(fā)表的牛的第二代圖譜上有1236個(gè)標(biāo)記，圖譜總長2990cM，常染色體上標(biāo)記間平均距離為2.5cM。到目前為止，已公布了四張豬的遺傳連鎖圖譜。在最近版的豬遺傳連鎖圖譜上微衛(wèi)星標(biāo)記共計(jì)1042個(gè)，總長度2286.2cM，標(biāo)記間平均距離為2.23cM。1992年Crawford等發(fā)表了第一張用微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建的綿羊遺傳連鎖圖譜，當(dāng)時(shí)所使用的微衛(wèi)星標(biāo)記很少。1998年de Gortari等發(fā)表了綿羊的第二代遺傳連鎖圖譜，其上共有標(biāo)記519個(gè)，其中504個(gè)為微衛(wèi)星，常染色體圖譜總長度為3063cM，標(biāo)記間距為6.4cM。這種高密度遺傳連鎖圖譜的建成為基因定位、物理圖譜的構(gòu)建及基因的位置克隆（Positional cloning）奠定了基礎(chǔ)。 3.2 數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）定位 QTL定位就是以一定飽和度的遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，通過連鎖分析，確定家畜QTL在圖譜上的位置、與特定標(biāo)記間的遺傳距離。QTL定位已成為目前家畜遺傳育種研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)課題，其中基因組掃描（Genome scanning）是QTL定位的主要方法之一，即以已經(jīng)構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜為基礎(chǔ)，利用連鎖分析的原理分析基因組中大量散在分布的多態(tài)性標(biāo)記（多數(shù)為微衛(wèi)星標(biāo)記）與數(shù)量性狀變異的連鎖關(guān)系，進(jìn)而借助這些標(biāo)記跟蹤對數(shù)量性狀表型有影響的功能基因在染色體上的位置及其效應(yīng)，從而找到QTL。Andersson等率先在一個(gè)由歐洲野公豬與大白豬建立的資源家系中發(fā)現(xiàn)豬4號染色體微衛(wèi)星S0001～S0107區(qū)域存在脂肪沉積和背膘厚的QTL。 3.3 標(biāo)記輔助選擇 借助微衛(wèi)星進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）具有廣闊的應(yīng)用前景。MAS的一個(gè)應(yīng)用是有利基因的轉(zhuǎn)移。在傳統(tǒng)的回交育種過程中，隨著有利基因的引入，與有利基因連鎖的不利基因（或染色體片段）也會隨之導(dǎo)入，成為連鎖累贅。然而利用與目的基因緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記，就可以直接選擇在目的基因附近發(fā)生重組的個(gè)體，從而避免或顯著減少連鎖累贅，提高選擇效率。MAS的另一應(yīng)用是基因的累加。家畜有許多基因的表型是相同的，在這種情況下，經(jīng)典的遺傳育種研究就無法區(qū)別不同的基因，因而無法鑒定一個(gè)性狀是受單個(gè)基因還是多個(gè)具有相同表型的基因共同控制。借助微衛(wèi)星標(biāo)記，先在不同親本中將基因定位，然后通過雜交或回交將不同的基因轉(zhuǎn)移至一個(gè)品種中，通過檢測與不同基因連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型來判斷個(gè)體是否含有某個(gè)或幾個(gè)基因，以幫助選擇。 3.4 遺傳多樣性評估 家畜遺傳多樣性一般指品種內(nèi)個(gè)體在DNA水平上的差異。通過對遺傳多樣性的評估，可了解家畜品種的遺傳結(jié)構(gòu)、生活背景，分析其進(jìn)化的歷史和潛力，以及探討品種瀕危的原因和現(xiàn)狀，提出合理的保種措施。為此，利用微衛(wèi)星標(biāo)記，檢測個(gè)體基因型，統(tǒng)計(jì)群體中的微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因的數(shù)目和頻率，結(jié)合分子遺傳學(xué)和數(shù)量分類學(xué)原理，計(jì)算各個(gè)品種的遺傳變異程度、生存穩(wěn)定性，初步評估品種的遺傳多樣性及品種間的關(guān)系親緣與分化關(guān)系。Kacirek等利用18個(gè)微衛(wèi)星分析了大白、約克夏及漢普夏三個(gè)豬種間的遺傳變異。楊瀾利用5對牛微衛(wèi)星引物和10對綿羊微衛(wèi)星引物分析了5個(gè)中國地方山羊品種的遺傳多樣性。 3.5 系譜確證 在家畜育種中必須搞清楚畜群的親子關(guān)系，這樣才能利于根據(jù)親屬信息準(zhǔn)確選留個(gè)體并能防止群體近交的發(fā)生。然而在某些情況下（如寄養(yǎng)、母畜返情重配等），卻不能準(zhǔn)確判斷某一個(gè)體的親代。如今借助多個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在群體中的等位基因頻率，通過計(jì)算排除率（Exclusion probability）便可進(jìn)行親子鑒定和血緣控制。Ellegren等研究表明，組合使用5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（每個(gè)位點(diǎn)有6個(gè)以上的等位基因）時(shí)排除率為98%，而使用10個(gè)這樣的微衛(wèi)星時(shí)排除率可高達(dá)99.99%[25]。Van Zereren等利用7對微衛(wèi)星引物對4個(gè)比利時(shí)豬種進(jìn)行親緣關(guān)系鑒定，排除率均超過95%。可見使用這種方法對家畜進(jìn)行系譜確證是非常適合的，因?yàn)榛蛐徒Y(jié)構(gòu)的基本元素對于親代和子代是完全相同的。 此外，微衛(wèi)星標(biāo)記還可應(yīng)用于疾病的基因診斷、性別控制、保護(hù)遺傳學(xué)等方面。相信隨著人們對微衛(wèi)星標(biāo)記認(rèn)識的不斷深入與完善，它必將成為家畜遺傳育種研究領(lǐng)域的一種強(qiáng)有力的工具,發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢。