本文以氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）測定飼料中違禁藥物三聚氰胺的含量。試樣中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，經(jīng)混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，用N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，以氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行定性和定量。

    1 試劑與材料
    1.1 衍生劑
    N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）；乙腈：色譜純；甲醇：色譜純；氨水：濃度25%～28%；混合型陽離子交換固相萃取柱：60mg，3mL；
    10g/L三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸10g加水溶解定容至1 000mL；
    5%氨水甲醇溶液：量取氨水5mL，用甲醇定容至100mL容量瓶中；
    22g/L乙酸溶液：稱取乙酸鉛22g用約300mL蒸餾水溶解后定容至1 000mL容量瓶中；
20%甲醇溶液：量取甲醇200mL加入超純水800mL，混勻；濾膜：0.45μm，有機相；三聚氰胺標準品（國家標準物質(zhì)中心提供）：純度≥99%。
    1.2 三聚氰胺標準溶液
    三聚氰胺標準儲備液：精確稱取三聚氰胺標準品100mg，用20%甲醇溶液溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，該溶液濃度為1.0mg/mL，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期3個月；
    三聚氰胺標準中間液：吸取三聚氰胺標準儲備液5.0mL，用20%甲醇溶液定容至50mL棕色容量瓶中，該溶液濃度為100μg/mL，于4℃冰箱內(nèi)貯存，有效期為1個月；
    三聚氰胺標準工作液：用移液管準確移取三聚氰胺標準中間液10mL，用20%甲醇溶液定容至100mL容量瓶中，該溶液濃度為10μg/mL，有效期為1周。
    1.3 儀器與設備
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（氣質(zhì)聯(lián)用儀）；離心機：10 000r/min；渦旋混合器：0～2 500r/min；超聲波清洗器；氮吹儀：可控溫至50℃；固相萃取裝置（帶真空泵）。

    2 測定步驟
    2.1 提取
    準確稱取飼料樣品5g（精確至0.0001g）至100mL具塞離心管中，準確加入10g/L三氯乙酸溶液50mL，加入22g/L乙酸鉛溶液2mL，搖勻，超聲提取30min，靜止2min，取上層提取液約30mL轉入50mL離心管中，置于離心機上10 000r/min離心10min，取至少15mL的樣品上清液過0.45μm濾膜。
    2.2 凈化
    分別用甲醇3mL，超純水3mL活化混合型陽離子交換固相萃取柱，準確移取樣品提取液10mL分次過柱，控制過柱速度在1.0mL/min以內(nèi)；再次用超純水3mL，甲醇3mL洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，抽至近干后用5%氨水甲醇溶液3mL洗脫；收集洗脫液于5mL具塞玻璃管中，置于氮吹儀上50℃氮氣吹干。
    2.3 衍生化
    將已吹干的玻璃管內(nèi)加入乙腈200μL，衍生劑200μL，置于渦旋混合器上充分混勻，放入70℃的培養(yǎng)箱內(nèi)衍生反應30min；同時準確移取三聚氰胺標準工作液1.0mL于5mL具塞玻璃管中，氮氣吹干后做同步衍生。

圖1 三聚氰胺標準品衍生物選擇離子色譜與質(zhì)譜圖

圖2 三聚氰胺空白樣品衍生物選擇離子色譜與質(zhì)譜圖

圖3 三聚氰胺添加樣品衍生物選擇離子色譜與質(zhì)譜圖

    2.4 測定
    2.4.1 GC-MS條件
    色譜柱：柱長30m，內(nèi)徑0.25mm，甲基苯基聚硅氧烷涂層，膜厚0.25μm；載氣：氦氣，流速為1.3mL/min；進樣量：1μL；進樣口溫度：250℃；升溫程序：起始溫度75℃，持續(xù)1.0min，以30℃/min升溫至300℃，保持2.0min；傳輸線溫度：280℃；運行時間：10.5min；掃描范圍：60～400m/z；掃描模式：選擇離子掃描，監(jiān)測離子99m/z、171m/z、327m/z、342m/z；離子源溫度：230℃；EI源轟擊能：70eV。
    2.4.2 測定
    定性方法：試樣與標準品保留時間的相對偏差不大于0.5%，特征離子豐度與標準品相差不大于20%。定量方法：以342、327、171和99峰面積之和進行單點校正定量。
    2.4.3 結果計算和表述
    試樣中三聚氰胺的含量X，以質(zhì)量分數(shù)mg/kg表示，單點校正按以下公式計算：

    X＝

    式中：
    A－試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；
    As－三聚氰胺標準溶液對應的色譜峰面積響應值；
    Cs－標準工作液中三聚氰胺的濃度，單位為μg/mL；
    V－用于衍生的試樣溶液體積（5.3），單位為mL；
    m－試樣質(zhì)量，單位為g；
    n－稀釋倍數(shù)。

表1  三聚氰胺標準品離散系數(shù)      %

序號	1	2	3	4	5	6	7	8
峰面積值	9 616 036	9 612 508	9 630 625	9 655 693	9 599 612	9 637 895	9 533 562	9 658 409
平均值 標準偏差 離散系數(shù)	9 621 417 41 725 0.43

表2  方法回收率與相對標準偏差      %

添加量 /（mg/kg）	回收率								平均 回收率	標準偏差
	1	2	3	4	5	6	7	8
2 5 10 25	91.8 96.2 95.7 98.3	93.2 95.8 97.8 97.6	94.5 93.8 98.2 99.1	92.9 94.6 98.1 98.2	94.8 93.7 97.6 97.9	93.6 94.9 98.9 98.5	92.7 95.3 98.6 98.5	91.7 96.6 98.4 98.7	93.2 95.1 97.9 98.4	1.06 1.00 0.92 0.44

    3 結果討論
    3.1 樣品加入50mL三氯乙酸溶液，再加入2mL乙酸鉛溶液，樣品的最終稀釋倍數(shù)是52倍。
    3.2 因為三聚氰胺微溶于水中和甲醇中，所以樣品加入三氯乙酸溶液后提取時間要充分，渦旋與超聲提取的時間均不宜過短，超聲提取后應再次渦旋混合均勻。
    3.3 通過表1可以看出，三聚氰胺標準品的離散系數(shù)為0.43%，表明此方法重復性好。
    3.4 通過三聚氰胺標準品衍生物選擇離子色譜與質(zhì)譜圖中顯示，三聚氰胺的出峰時間約在7.0min左右，但在實際檢測中，每一進針時間不宜低于10.5min；利用載氣流動相（氦氣）的沖洗，可以將色譜柱中的殘留物沖洗干凈，以利于下一進針樣品減少雜峰的出現(xiàn)。
    3.5 通過表2可以看出，三聚氰胺在飼料中的回收率在93.2%～98.4%，當添加濃度低時，回收率也會相應降低，當添加濃度提高時，回收率也隨之升高；添加量在2mg/kg以上時，回收率基本上穩(wěn)定在93%以上，添加量高于25mg/kg時，回收率的變化不會太大，基本上也穩(wěn)定在98%～110%；但當添加量小于0.05mg/kg時，回收率會降至80%以下，甚至更低，而且會出現(xiàn)被測樣品雜峰高于三聚氰胺峰的現(xiàn)象；通過回收率的測定值也可以證明此方法具有很好的可行性。
    3.6 此方法操作簡單易行，單一樣品的檢測時間在30min左右，樣品的提取也不是很復雜，還具有較高回收率與低離散系數(shù)等優(yōu)點，并且本方法在樣品處理液進行衍生時采用以乙腈代替吡啶的試驗，也收到了很好的效果，減小了有機試劑對飼料檢測人員的傷害，并且也可減小對環(huán)境的污染。
    3.7 在三聚氰胺樣品處理液過混合型陽離子交換萃取柱時，過濾速度不宜太快，速度宜保持穩(wěn)定；用氨化甲醇洗脫時，殘留于混合型陽離子交換萃取柱中的溶液應盡量抽干；在實際檢測中，有時會遇到樣品處理液極難通過固相萃取柱，此種情況可能是被處理樣品中含有較高的脂肪所造成的；這時就不宜再用3mL水來洗滌固相萃取柱，而改用50%甲醇水溶液3mL來預洗，再用純甲醇3mL洗滌。
    3.8 試樣溶液在被氮氣吹干時，氮吹儀的溫度不可過高，否則吹干后的試管壁顏色發(fā)黑；加入乙腈與衍生劑后，渦旋時間不宜過短。
    3.9 試樣溶液在通過0.45μm有機濾膜過濾后，如果顏色混濁可以用濾膜再過濾一次，或者通過離心機離心使溶液清轍后再過濾0.45μm有機濾膜。
    3.10 三聚氰胺在上機檢測之前，應將儀器充分預熱，會較好的提高檢測回收率與降低離散系數(shù)。
    3.11 每一針樣品檢測完畢后，應用乙腈充分清洗自動進樣針，可以減小樣品間的相互污染問題。
    3.12 回收率的測定按照公式進行計算，但不除以樣品質(zhì)量（即公式中m值）；回收率是以添加的三聚氰胺標準中間液（3.12.2），濃度為100μg/mL的標準點添加到被測試樣中；測定計算的標準品峰面積值（公式中的As值）是按照表1中標準品平均峰面積值進行比較計算的；此方法為外標定量法，具體參照中國國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標準“NY/T 1372-2007飼料中三聚氰胺的測定”中氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的規(guī)定進行。
    3.13 標準品中三聚氰胺的出峰保留時間是在7.00min，當檢測飼料樣品時，飼料樣品的保留時間與標準品的保留時間相對偏差不能大于0.5%，并且飼料樣品的監(jiān)測離子171m/z、327m/z、342m/z應與99m/z相比較，比例應當正常（參照標準品的監(jiān)測離子比例）；如果出峰時間超出偏差并且監(jiān)測離子比例不當，應考慮不是三聚氰胺峰，而是樣品雜峰。
    3.14 以氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）與高效液相色譜法（HPLC）檢測飼料中的三聚氰胺相比較時，GC-MS法最低檢出限為0.05mg/kg，HPLC法最低檢出限為2.0mg/kg，GC-MS法靈敏度要好于HPLC法；不過GC-MS法衍生過程的不確定因素較多，中間人員操作因素影響也較大，所以重現(xiàn)性與HPLC法相比要差一些。有研究表明：用HPLC法對323批次飼料樣品進行三聚氰胺的檢測，檢出含三聚氰胺的飼料樣品為56批，檢出率高達17.33%，而用GC-MS法只檢出8批次，檢出率僅為2.47%，造成這種偏差的原因可能是由于飼料中的成分比較復雜，含有與三聚氰胺結構相似的物質(zhì)，因此，飼料中三聚氰胺含量的檢測用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準的GC-MS法較佳。
    （參考文獻略）

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