歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis(Hbn.)是北美嚴重影響玉米產量和品質最重要的害蟲,轉Bt基因抗蟲玉米(以下簡稱Bt玉米)的商品化,為控制玉米螟為害提供了新的途徑。
一、Bt玉米的培育
植物遺傳研究人員將選定的外源DNA插入玉米植株的DNA。為了保持產量、豐產性和抗病性等重要的農藝性狀,種子公司選擇優良的雜交種用來作Bt玉米的轉育。
導入玉米的基因載體由3種基本成分組成:(1)蛋白質基因。即為更好的在玉米體內表達,產生晶體蛋白的經過修飾的Bt基因,目前在美國和加拿大應用的第一代Bt玉米雜交種所表達的是Cryl Ab、Cryl Ac或Cry9C中的一種基因。在不久的將來,轉基因雜交種可能會產生其他晶體蛋白或其他來源的蛋白。(2)啟動子。是用來控制晶體蛋白在植株體內表達部位和表達量的,有些啟動子限定晶體蛋白在植株的特定部位如光合作用的綠色組織和花粉中表達,如PEPC,而有些啟動子可以在全株表達晶體蛋白,如CaMV/35S。(3)標記基因。標記基因的存在可以使種子公司鑒定是否已將外源基因成功導入。常用的標記基因包括抗除草劑基因如Round Up和Liberty R以及抗體基因。
通過不同的植物轉化技術將基因載體插入到玉米中并成功的轉化,稱為轉化子,轉化子將基因載體和Bt DNA切入到玉米DNA的部位不同。切入點的不同可影響Bt蛋白的表達并可能影響植株的其他功能。因此,種子公司很認真地審查轉化子,以確保Bt蛋白的產生對農藝性狀沒有副作用。
Bt玉米于1995年經美國環境保護局(EPA)批準登記后,到1997年9月美國環境保護局(EPA)已登記了4種用于商業的不同轉化子,它們是:Novartis種子公司和Mycogen種子公司的176,Northrup King/Novartis種子公司的BT11,孟山都(Monsanto)公司的MON810和DEKALB公司的DBT418。176分別被Novartis和Mycogen注冊商標為“Knock Out”和“Nature Gard”,而BT11和MON810的商標均為“Yield Gard”,DBT418的商標為“Bt-Xtra”,最近,Agr Evo公司將CBH351轉化子注冊為“Stralink”。176、BT11和MON810轉化子表達的蛋白均為Cryl Ab,DBT418表達的蛋白為Cryl Ac,而CBH351所表達的為Cry9c。了解這些轉化子和它們如何影響表達對選擇玉米雜交種是至關重要的。
二、Bt玉米的殺蟲效果及對天敵的影響
1 對歐洲玉米螟的控制作用同現行的綜合防治技術相比,Bt玉米有明顯改進對歐洲玉米螟控制的潛力,化學殺蟲劑在施用適時的情況下,對第一代和第二代玉米螟幼蟲的防效分別是60%~95%和40%~80%。任何一種Bt玉米對心葉期一代玉米螟的控制效果均在99%以上,而對二代玉米螟幼蟲的控制效果則因品種而異。這同Bt玉米品種之間的Bt基因種類以及在玉米植株體內表達的部位有關,如在大量人工接種條件下, BT11和MON810和176對心葉期一代玉米暝的防效都高達96%左右,雖然這3個品種表達的Bt基因均為Cryl Ab,但對穗期二代螟的防效卻明顯不同,176的防效僅有75%,其原因是BT11和MON810全株都能產生晶體蛋白,而176僅在植株的綠色組織和花粉中產生毒蛋白,部分取食花絲和子粒的幼蟲后期鉆蛀莖稈和穗軸。而在不同Bt玉米植株不同發育階段人工接種4齡的歐洲玉米螟幼蟲, BT11和MON810和CBH351可以有效控制玉米螟為害,176在營養生長階段可以有效控制大齡玉米螟幼蟲,但在抽雄進入生殖生長階段后,其蛀孔隧道數增加,而DBT418在營養生長和生殖生長階段對大齡幼蟲的控制效果均不理想。另有田間試驗表明,取食Bt玉米CBH351葉片的2~4齡歐洲玉米螟在4d內全部死亡,即使在過量的人工接種下,平均每株蛀孔隧道長度僅為0.09~0.14cm,而對照則分別為30和23cm。
2 Bt玉米對玉米其他害蟲及病害的控制作用根據在衣阿華州和堪薩斯州實驗室和田間試驗結果表明,目前應用的Bt玉米對蚜蟲、玉米葉螨、地老虎,以及地下害蟲玉米切根葉甲、金針蟲、蠐螬、瓜種蠅和玉米小螻甲等害蟲無效。肯塔基大學的研究表明,對玉米的其他害蟲控制效果因Bt玉米轉化子的不同而異,表達Cryl Ab和Cryl Ac基因的Bt玉米對地老虎無效,但初步的田間試驗表明,表達Cry9c基因的CBH351Bt玉米對地老虎有很好的控制作用。BT11和MON810可以使玉米穗蟲為害降低50%~70%,對秋黏蟲的防效可達50%~70%,而176卻效果很差,同時表達BT11和MON810的子粒對印度谷螟有很好的控制作用,176則無效。不同Bt玉米對西南玉米螟的控制效果明顯不同。
由于Bt玉米降低了病原菌可以侵入的孔道,因此,可以降低玉米莖、穗粒腐病的發生,連續3年的研究表明,在人工接種玉米螟后,與非BT對照玉米相比,在表達Cryl Ab的BT玉米上由鐮刀菌引起的玉米穗腐發病率、嚴重程度和粒腐率,分別下降了58%~68%、54%~96%和17%~38%,同時,還減輕了黃曲霉毒素對玉米子粒的污染。
3 BT玉米對有益昆蟲和害蟲天敵的影響大量研究結果表明,BT晶體蛋白對殺死鱗翅目幼蟲有極高的選擇性。BT玉米對有益昆蟲包括蜜蜂、瓢蟲、草蛉幼蟲、蜘蛛、獵蝽和寄生蜂沒有不良影響,如對取食含有Bt毒蛋白花粉的捕食性天敵十二星瓢蟲和小暗色花蝽的生長和捕食能力無明顯影響,Bt玉米上歐洲玉米螟卵以及幼蟲的被捕食率和寄生率以及捕食性天敵的數量同非Bt玉米上的差異并不顯著。在實驗室用取食Bt和非Bt玉米的歐洲玉米螟飼養普通草蛉幼蟲,在死亡率上沒有明顯差異,但取食前者的草蛉幼蟲發育時間較后者延長,表明Bt降低了草蛉幼蟲的適合度,可能是Bt與病態獵物引起的營養不足共同影響所致。盡管如此,Bt玉米對歐洲玉米螟天敵的間接影響是存在的,捕食性、寄生性天敵及病原菌的數量可能隨玉米螟種群數量的下降而降低。
三、歐洲玉米螟對Bt玉米的抗性預測及其治理
1 產生抗性的可能性已知昆蟲有對某些農藥較快地產生抗性的能力,抗性產生的部分原因是農藥的高濃度條件下的頻繁施用。目前已有500多種昆蟲和螨類對殺蟲劑和殺螨劑產生了抗性,因此,歐洲玉米螟有對Bt晶體蛋白產生抗性的潛在能力。目前,已有15種不同昆蟲的實驗室群體對Bt蛋白產生了抗性,這些昆蟲包括印度谷螟、煙芽夜蛾、甜菜夜蛾、紅鈴蟲以及馬鈴薯甲蟲。而在美國的夏威夷和佛羅里達州的小菜蛾田間種群已對Bt殺蟲劑產生了很高的抗性。
影響抗性發展的因素有很多,對歐洲玉米螟來說,這些因素包括:Bt玉米種植的面積、玉米螟在生長季節的較高死亡率以及每年發生兩代或更多世代。在明尼蘇達、堪薩斯和特拉華州的實驗室研究已確信,歐洲玉米螟能夠對Bt殺蟲劑或Bt晶體蛋白產生中等程度的抗性,殺死這些抗性品系50%的種群所需毒蛋白比敏感品系要高出30~60多倍,這些中等抗性水平的歐洲玉米螟是在相對小的實驗室種群在用Bt蛋白處理7~9代后產生的。將玉米螟連續飼養在加入不同濃度純化的Cryl Ab蛋白的人工飼料上,結果表明,玉米螟對人工飼料中低濃度的Cryl Ab可以產生一定程度的耐性,但在接近Bt玉米實際表達量的Cryl Ab的濃度的人工飼料上取食的玉米螟群體卻不能保存下來,而且在經過13代的汰選后的不同玉米螟群體,接種到溫室中表達Cryl Ab的Bt玉米上后都不能存活。雖然這些研究結果確認歐洲玉米螟有對Bt產生抗性的遺傳潛力,但實驗室研究并不能證明在田間條件下可以產生抗性。在田間條件下Bt玉米和歐洲玉米螟處在一個完全不同于歐洲玉米螟在實驗室取食Bt殺蟲劑的環境。盡管如此,歐洲玉米螟對Bt玉米產生抗性的威脅確實存在。
2 對Bt玉米產生抗性的預防及治理面對歐洲玉米螟有可能對Bt玉米產生抗性的潛在威脅,有必要制定避免或延緩抗性風險產生的治理規劃??剐灾卫硎呛οx綜合治理實踐的一個關鍵因子,美國環保署對Bt玉米商品化簽署的是有條件的注冊,需要銷售Bt玉米種子的公司在2001年制定并實施抗性治理規劃。
目前Bt玉米抗性治理是基于兩個互補原則,高劑量和避難所。植物遺傳工作者設計的Bt玉米能產生非常高水平的Bt晶體蛋白,遠高于防治玉米螟Bt殺蟲劑的用量,目的是殺死所有沒有抗性基因(rr)和有1個抗性基因(rs)的歐洲玉米螟幼蟲,這種假設是基于Bt玉米雜交種已達到這種高劑量的目標。如果高劑量的目標不能達到,帶有1個抗性基因的玉米螟幼蟲可以存活至成蟲,并與帶有其他抗性基因的成蟲交尾,大多數這種組合的后代有可能對Bt玉米產生抗性,經逐代積累,抗性頻率不斷加大,而Bt玉米由于不斷表達毒蛋白,為抗性產生提供了理想的環境條件。
抗性治理規劃的第二個原則是應用避難所,是目前唯一有效的抗性治理措施,避難所的目的是為歐洲玉米螟提供非Bt玉米或Bt農藥環境,可以與來自附近Bt玉米的潛在抗性玉米螟交尾。避難所的目標是為每一個抗性成蟲提供過量的敏感成蟲。避難所可以是任一歐洲玉米螟的非Bt寄主,包括非Bt玉米、馬鈴薯、甜玉米、棉花或田間雜草寄主。在避難所內也不能應用Bt生物農藥顆粒劑或進行葉面噴霧,只有在歐洲玉米螟暴發時,利用殺蟲劑防治避難所內的非Bt玉米,以使經濟損失減低到最低程度,同時仍可提供足夠量的敏感玉米螟。至于避難所的面積,根據歐洲玉米螟生物學、抗藥性方面的知識和計算機模擬模型估計,避難所的面積應接近20-30%。同時,Bt和非Bt玉米的田間布局也是非常重要的,避難所的玉米螟必須與抗性玉米螟同時羽化,而且在能夠與抗性玉米螟交尾的范圍內。因此,每一農場應該在毗鄰Bt玉米田設有一個或多個避難所。
避難所的實際數量因地區、農場以及玉米生產體系而異,但將暴露在Bt蛋白上的幼蟲種群控制在20-30%的目標是一致的。在玉米連作混合大豆與玉米輪作區,主要的避難所為非Bt玉米,因此玉米播種面積的20-30%應為非Bt玉米。在應用殺蟲劑防治玉米螟的玉米連作區,避難所的面積應提高到40%以補償幼蟲死亡率。在玉米播種面積小,且與歐洲玉米螟種群相關的轉換寄主不包含Bt蛋白的地區,較小規模的避難所是可行的,這種避難所規模的降低是基于來源于轉換寄主和玉米上的玉米螟同期羽化的假設。當來源于當地非Bt寄主的玉米螟種群的比例不詳的,種植20-30%的非Bt玉米避難所是延緩抗性最簡單和最保險的措施。
一、Bt玉米的培育
植物遺傳研究人員將選定的外源DNA插入玉米植株的DNA。為了保持產量、豐產性和抗病性等重要的農藝性狀,種子公司選擇優良的雜交種用來作Bt玉米的轉育。
導入玉米的基因載體由3種基本成分組成:(1)蛋白質基因。即為更好的在玉米體內表達,產生晶體蛋白的經過修飾的Bt基因,目前在美國和加拿大應用的第一代Bt玉米雜交種所表達的是Cryl Ab、Cryl Ac或Cry9C中的一種基因。在不久的將來,轉基因雜交種可能會產生其他晶體蛋白或其他來源的蛋白。(2)啟動子。是用來控制晶體蛋白在植株體內表達部位和表達量的,有些啟動子限定晶體蛋白在植株的特定部位如光合作用的綠色組織和花粉中表達,如PEPC,而有些啟動子可以在全株表達晶體蛋白,如CaMV/35S。(3)標記基因。標記基因的存在可以使種子公司鑒定是否已將外源基因成功導入。常用的標記基因包括抗除草劑基因如Round Up和Liberty R以及抗體基因。
通過不同的植物轉化技術將基因載體插入到玉米中并成功的轉化,稱為轉化子,轉化子將基因載體和Bt DNA切入到玉米DNA的部位不同。切入點的不同可影響Bt蛋白的表達并可能影響植株的其他功能。因此,種子公司很認真地審查轉化子,以確保Bt蛋白的產生對農藝性狀沒有副作用。
Bt玉米于1995年經美國環境保護局(EPA)批準登記后,到1997年9月美國環境保護局(EPA)已登記了4種用于商業的不同轉化子,它們是:Novartis種子公司和Mycogen種子公司的176,Northrup King/Novartis種子公司的BT11,孟山都(Monsanto)公司的MON810和DEKALB公司的DBT418。176分別被Novartis和Mycogen注冊商標為“Knock Out”和“Nature Gard”,而BT11和MON810的商標均為“Yield Gard”,DBT418的商標為“Bt-Xtra”,最近,Agr Evo公司將CBH351轉化子注冊為“Stralink”。176、BT11和MON810轉化子表達的蛋白均為Cryl Ab,DBT418表達的蛋白為Cryl Ac,而CBH351所表達的為Cry9c。了解這些轉化子和它們如何影響表達對選擇玉米雜交種是至關重要的。
二、Bt玉米的殺蟲效果及對天敵的影響
1 對歐洲玉米螟的控制作用同現行的綜合防治技術相比,Bt玉米有明顯改進對歐洲玉米螟控制的潛力,化學殺蟲劑在施用適時的情況下,對第一代和第二代玉米螟幼蟲的防效分別是60%~95%和40%~80%。任何一種Bt玉米對心葉期一代玉米螟的控制效果均在99%以上,而對二代玉米螟幼蟲的控制效果則因品種而異。這同Bt玉米品種之間的Bt基因種類以及在玉米植株體內表達的部位有關,如在大量人工接種條件下, BT11和MON810和176對心葉期一代玉米暝的防效都高達96%左右,雖然這3個品種表達的Bt基因均為Cryl Ab,但對穗期二代螟的防效卻明顯不同,176的防效僅有75%,其原因是BT11和MON810全株都能產生晶體蛋白,而176僅在植株的綠色組織和花粉中產生毒蛋白,部分取食花絲和子粒的幼蟲后期鉆蛀莖稈和穗軸。而在不同Bt玉米植株不同發育階段人工接種4齡的歐洲玉米螟幼蟲, BT11和MON810和CBH351可以有效控制玉米螟為害,176在營養生長階段可以有效控制大齡玉米螟幼蟲,但在抽雄進入生殖生長階段后,其蛀孔隧道數增加,而DBT418在營養生長和生殖生長階段對大齡幼蟲的控制效果均不理想。另有田間試驗表明,取食Bt玉米CBH351葉片的2~4齡歐洲玉米螟在4d內全部死亡,即使在過量的人工接種下,平均每株蛀孔隧道長度僅為0.09~0.14cm,而對照則分別為30和23cm。
2 Bt玉米對玉米其他害蟲及病害的控制作用根據在衣阿華州和堪薩斯州實驗室和田間試驗結果表明,目前應用的Bt玉米對蚜蟲、玉米葉螨、地老虎,以及地下害蟲玉米切根葉甲、金針蟲、蠐螬、瓜種蠅和玉米小螻甲等害蟲無效。肯塔基大學的研究表明,對玉米的其他害蟲控制效果因Bt玉米轉化子的不同而異,表達Cryl Ab和Cryl Ac基因的Bt玉米對地老虎無效,但初步的田間試驗表明,表達Cry9c基因的CBH351Bt玉米對地老虎有很好的控制作用。BT11和MON810可以使玉米穗蟲為害降低50%~70%,對秋黏蟲的防效可達50%~70%,而176卻效果很差,同時表達BT11和MON810的子粒對印度谷螟有很好的控制作用,176則無效。不同Bt玉米對西南玉米螟的控制效果明顯不同。
由于Bt玉米降低了病原菌可以侵入的孔道,因此,可以降低玉米莖、穗粒腐病的發生,連續3年的研究表明,在人工接種玉米螟后,與非BT對照玉米相比,在表達Cryl Ab的BT玉米上由鐮刀菌引起的玉米穗腐發病率、嚴重程度和粒腐率,分別下降了58%~68%、54%~96%和17%~38%,同時,還減輕了黃曲霉毒素對玉米子粒的污染。
3 BT玉米對有益昆蟲和害蟲天敵的影響大量研究結果表明,BT晶體蛋白對殺死鱗翅目幼蟲有極高的選擇性。BT玉米對有益昆蟲包括蜜蜂、瓢蟲、草蛉幼蟲、蜘蛛、獵蝽和寄生蜂沒有不良影響,如對取食含有Bt毒蛋白花粉的捕食性天敵十二星瓢蟲和小暗色花蝽的生長和捕食能力無明顯影響,Bt玉米上歐洲玉米螟卵以及幼蟲的被捕食率和寄生率以及捕食性天敵的數量同非Bt玉米上的差異并不顯著。在實驗室用取食Bt和非Bt玉米的歐洲玉米螟飼養普通草蛉幼蟲,在死亡率上沒有明顯差異,但取食前者的草蛉幼蟲發育時間較后者延長,表明Bt降低了草蛉幼蟲的適合度,可能是Bt與病態獵物引起的營養不足共同影響所致。盡管如此,Bt玉米對歐洲玉米螟天敵的間接影響是存在的,捕食性、寄生性天敵及病原菌的數量可能隨玉米螟種群數量的下降而降低。
三、歐洲玉米螟對Bt玉米的抗性預測及其治理
1 產生抗性的可能性已知昆蟲有對某些農藥較快地產生抗性的能力,抗性產生的部分原因是農藥的高濃度條件下的頻繁施用。目前已有500多種昆蟲和螨類對殺蟲劑和殺螨劑產生了抗性,因此,歐洲玉米螟有對Bt晶體蛋白產生抗性的潛在能力。目前,已有15種不同昆蟲的實驗室群體對Bt蛋白產生了抗性,這些昆蟲包括印度谷螟、煙芽夜蛾、甜菜夜蛾、紅鈴蟲以及馬鈴薯甲蟲。而在美國的夏威夷和佛羅里達州的小菜蛾田間種群已對Bt殺蟲劑產生了很高的抗性。
影響抗性發展的因素有很多,對歐洲玉米螟來說,這些因素包括:Bt玉米種植的面積、玉米螟在生長季節的較高死亡率以及每年發生兩代或更多世代。在明尼蘇達、堪薩斯和特拉華州的實驗室研究已確信,歐洲玉米螟能夠對Bt殺蟲劑或Bt晶體蛋白產生中等程度的抗性,殺死這些抗性品系50%的種群所需毒蛋白比敏感品系要高出30~60多倍,這些中等抗性水平的歐洲玉米螟是在相對小的實驗室種群在用Bt蛋白處理7~9代后產生的。將玉米螟連續飼養在加入不同濃度純化的Cryl Ab蛋白的人工飼料上,結果表明,玉米螟對人工飼料中低濃度的Cryl Ab可以產生一定程度的耐性,但在接近Bt玉米實際表達量的Cryl Ab的濃度的人工飼料上取食的玉米螟群體卻不能保存下來,而且在經過13代的汰選后的不同玉米螟群體,接種到溫室中表達Cryl Ab的Bt玉米上后都不能存活。雖然這些研究結果確認歐洲玉米螟有對Bt產生抗性的遺傳潛力,但實驗室研究并不能證明在田間條件下可以產生抗性。在田間條件下Bt玉米和歐洲玉米螟處在一個完全不同于歐洲玉米螟在實驗室取食Bt殺蟲劑的環境。盡管如此,歐洲玉米螟對Bt玉米產生抗性的威脅確實存在。
2 對Bt玉米產生抗性的預防及治理面對歐洲玉米螟有可能對Bt玉米產生抗性的潛在威脅,有必要制定避免或延緩抗性風險產生的治理規劃??剐灾卫硎呛οx綜合治理實踐的一個關鍵因子,美國環保署對Bt玉米商品化簽署的是有條件的注冊,需要銷售Bt玉米種子的公司在2001年制定并實施抗性治理規劃。
目前Bt玉米抗性治理是基于兩個互補原則,高劑量和避難所。植物遺傳工作者設計的Bt玉米能產生非常高水平的Bt晶體蛋白,遠高于防治玉米螟Bt殺蟲劑的用量,目的是殺死所有沒有抗性基因(rr)和有1個抗性基因(rs)的歐洲玉米螟幼蟲,這種假設是基于Bt玉米雜交種已達到這種高劑量的目標。如果高劑量的目標不能達到,帶有1個抗性基因的玉米螟幼蟲可以存活至成蟲,并與帶有其他抗性基因的成蟲交尾,大多數這種組合的后代有可能對Bt玉米產生抗性,經逐代積累,抗性頻率不斷加大,而Bt玉米由于不斷表達毒蛋白,為抗性產生提供了理想的環境條件。
抗性治理規劃的第二個原則是應用避難所,是目前唯一有效的抗性治理措施,避難所的目的是為歐洲玉米螟提供非Bt玉米或Bt農藥環境,可以與來自附近Bt玉米的潛在抗性玉米螟交尾。避難所的目標是為每一個抗性成蟲提供過量的敏感成蟲。避難所可以是任一歐洲玉米螟的非Bt寄主,包括非Bt玉米、馬鈴薯、甜玉米、棉花或田間雜草寄主。在避難所內也不能應用Bt生物農藥顆粒劑或進行葉面噴霧,只有在歐洲玉米螟暴發時,利用殺蟲劑防治避難所內的非Bt玉米,以使經濟損失減低到最低程度,同時仍可提供足夠量的敏感玉米螟。至于避難所的面積,根據歐洲玉米螟生物學、抗藥性方面的知識和計算機模擬模型估計,避難所的面積應接近20-30%。同時,Bt和非Bt玉米的田間布局也是非常重要的,避難所的玉米螟必須與抗性玉米螟同時羽化,而且在能夠與抗性玉米螟交尾的范圍內。因此,每一農場應該在毗鄰Bt玉米田設有一個或多個避難所。
避難所的實際數量因地區、農場以及玉米生產體系而異,但將暴露在Bt蛋白上的幼蟲種群控制在20-30%的目標是一致的。在玉米連作混合大豆與玉米輪作區,主要的避難所為非Bt玉米,因此玉米播種面積的20-30%應為非Bt玉米。在應用殺蟲劑防治玉米螟的玉米連作區,避難所的面積應提高到40%以補償幼蟲死亡率。在玉米播種面積小,且與歐洲玉米螟種群相關的轉換寄主不包含Bt蛋白的地區,較小規模的避難所是可行的,這種避難所規模的降低是基于來源于轉換寄主和玉米上的玉米螟同期羽化的假設。當來源于當地非Bt寄主的玉米螟種群的比例不詳的,種植20-30%的非Bt玉米避難所是延緩抗性最簡單和最保險的措施。