葡萄糖氧化酶(ＧｌｕｃｏｓｅＯｘｉｄａｓｅ,簡稱ＧＯＤ)是一種需氧脫氫酶,能專一地氧化β-Ｄ-葡萄糖成為葡萄糖酸和過氧化氫。1928年Ｍｕｌｌｅｒ首先從黑曲霉的無細胞提取液中發現葡萄糖氧化酶。1960年Ｋｕｓａｉ等、1964年Ｐａｚｕｒ和Ｓｗｏｂｏｄ-ｄａ分別從青霉素和黑曲霉中提純葡萄糖氧化酶。1995年,Ｐｅｔｒｕｃｃｉｏｌｉ等用青霉素的突變株生產出葡萄糖氧化酶。我國自1986年開始研究葡萄糖氧化酶的制備提純工藝,1998年正式投入生產,1999年農業部將其定為12種允許使用的飼料酶制劑添加劑之一。
1 葡萄糖氧化酶的理化性質
高純度葡萄糖氧化酶為淡黃色粉末,易溶于水,不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機溶劑,50%丙酮、60%甲醇能使其沉淀。一般制品中均含有氧化氫酶,酶的最大光吸收波長為377～455ｎｍ。在紫外光下無熒光,但在熱、酸或堿處理后具有特殊的綠色。固體葡萄糖氧化酶制劑在0℃下保存至少穩定2年,在-15℃下則可穩定8年。葡萄糖氧化酶穩定的ｐＨ值范圍為3～4,最適ｐＨ值為5,如果沒有葡萄糖等保護劑的存在,ｐＨ值大于8或小于3葡萄糖氧化酶將迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用溫度為30～60℃,該酶不受乙二胺四乙酸、氰化鉀及氟化鈉抑制,但受氯化汞、氯化銀、對氯汞苯甲酸和苯肼抑制。
2 葡萄糖氧化酶在飼料行業中的應用
作為國家允許使用的飼料酶制劑之一,葡萄糖氧化酶在食品、醫藥、飼料等行業中得到了廣泛應用。葡萄糖氧化酶是一種新型的酶制劑,能夠改善動物腸道環境,調節飼糧消化,促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物(ＬＰＯ)和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑,可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉,并有促進動物生長作用。加有葡萄糖氧化酶的青貯飼料對長膘的牛有利,其原因是葡萄糖氧化酶可以消耗青貯的氧氣,提高青貯內的缺氧程度,有利于厭氧性乳酸菌的增殖,加快了乳酸菌的發酵過程,迅速產生大量乳酸,使青貯的ｐＨ值很快下降,抑制了有害細菌的繁殖,避免了異常發酵,最終保證青貯質量。
3 葡萄糖氧化酶促生長的作用機理
3.1 消除腸道病原菌生存環境
保持腸道菌群生態平衡 葡萄糖氧化酶能催化腸道內的葡萄糖產生葡萄糖酸和過氧化氫,當過氧化氫積累到一定濃度時,直接抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌的生長繁殖。其作用機理完全不同于抗生素,不會產生菌體抗藥性或藥物殘留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除腸道內氧氣,為厭氧有益菌雙歧桿菌的增殖制造厭氧環境;生成的葡萄糖酸可降低胃腸內ｐＨ值為乳酸菌生長制造酸性環境。有益菌大量增殖形成微生態競爭優勢,不利于大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌存活,控制感染,排除腐敗物質,提高巨噬細胞活性,從而提高機體免疫力。
3.2 保護腸道上皮細胞完整
腸道上皮細胞保持高度的物理完整,可以阻擋大量病原體的侵入。畜禽處于應激狀態時,過多有氧化作用的“自由基”會破壞腸道上皮細胞,而葡萄糖氧化酶具有氧化作用,能清除自由基,保護腸道上皮細胞完整。
3.3 改善腸道酸性消化環境 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸,在腸道內發揮酸化劑的作用,創造酸性環境;降低胃中的ｐＨ值,激活胃蛋白酶,促進礦物質和維生素Ａ、Ｄ的吸收,并且酸性腸道環境可減少有害菌繁殖,預防腹瀉。葡萄糖氧化酶還能同時改善飼料的適口性,在動物出現拒食、厭食、消化不良、腹瀉時,添加葡萄糖氧化酶可以使動物迅速恢復正常采食。
3.4 解除腸道霉菌毒素中毒
葡萄糖氧化酶直接抑制黃曲霉、黑根霉、青霉等多種霉菌,對黃曲霉毒素Ｂ1中毒癥有很好的預防效果。高溫季節,飼料發霉產生的毒素會使動物肝腫大、胸腺萎縮、巨噬細胞受到毒害,進而導致免疫抑制。添加葡萄糖氧化酶則可防治這些癥狀。
4 葡萄糖氧化酶的制備提純方法
發酵法生產檸檬酸和葡萄糖酸的廢菌絲富含葡萄糖氧化酶,是工業生產葡萄糖氧化酶的理想資源。對工業廢菌絲的處理還可以減輕由其造成的環境污染。有研究表明,用葡萄糖酸發酵的工業廢菌絲生產葡萄糖氧化酶,通過有機溶劑沉淀聚乙二醇二次沉淀、羥基磷灰石柱色譜分離,可得到比活性超過190Ｕ/ｍｇ蛋白的產品-葡萄糖氧化酶。由于黑曲霉或青霉在產生葡萄糖氧化酶的同時還常伴有過氧化氫酶(主要)、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白質的產生,因此有必要首先對葡萄糖氧化酶進行提純,以除去雜蛋白。常用純化方法如下:
4.1 沉淀法
選擇適宜沉淀劑濃度通過分級沉淀或一步沉淀可將葡萄糖氧化酶和其他蛋白質初步分開。沉淀操作需在低溫下進行,因為葡萄糖氧化酶在室溫下對某些沉淀劑不穩定易失活。
4.2 吸附法
吸附材料的吸附機理是在一定條件下,吸附材料的活性基團與葡萄糖氧化酶通過疏水相互作用而被吸附,然后通過改變緩沖液的濃度和ｐＨ值而改變吸附材料中活性基團的電離狀態使葡萄糖氧化酶與吸附劑解吸。
4.3 離子交換法
葡萄糖氧化酶的等電點在4 9左右,而過氧化氫酶的等電點在6 5附近。因此在提純葡萄糖氧化酶時應選用陰離子交換劑,且在ｐＨ值大于4 9時上樣和淋洗,此時葡萄糖氧化酶帶負電荷,可被陰離子交換劑吸附留柱,而過氧化氫酶帶正電荷隨淋洗液流下,從而使二者得以分離,最后用ｐＨ值小于4.2的緩沖液洗柱,使葡萄糖氧化酶帶正電荷而從柱上被洗脫。
5 結語
葡萄糖氧化酶不僅能夠代替抗菌藥物,而且還能代替抗球蟲藥物,是一種新型綠色飼料添加劑。隨著制備提純工藝的不斷發展完善,葡萄糖氧化酶將在飼料行業中發揮越來越重要的作用。
1 葡萄糖氧化酶的理化性質
高純度葡萄糖氧化酶為淡黃色粉末,易溶于水,不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有機溶劑,50%丙酮、60%甲醇能使其沉淀。一般制品中均含有氧化氫酶,酶的最大光吸收波長為377～455ｎｍ。在紫外光下無熒光,但在熱、酸或堿處理后具有特殊的綠色。固體葡萄糖氧化酶制劑在0℃下保存至少穩定2年,在-15℃下則可穩定8年。葡萄糖氧化酶穩定的ｐＨ值范圍為3～4,最適ｐＨ值為5,如果沒有葡萄糖等保護劑的存在,ｐＨ值大于8或小于3葡萄糖氧化酶將迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用溫度為30～60℃,該酶不受乙二胺四乙酸、氰化鉀及氟化鈉抑制,但受氯化汞、氯化銀、對氯汞苯甲酸和苯肼抑制。
2 葡萄糖氧化酶在飼料行業中的應用
作為國家允許使用的飼料酶制劑之一,葡萄糖氧化酶在食品、醫藥、飼料等行業中得到了廣泛應用。葡萄糖氧化酶是一種新型的酶制劑,能夠改善動物腸道環境,調節飼糧消化,促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物(ＬＰＯ)和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑,可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉,并有促進動物生長作用。加有葡萄糖氧化酶的青貯飼料對長膘的牛有利,其原因是葡萄糖氧化酶可以消耗青貯的氧氣,提高青貯內的缺氧程度,有利于厭氧性乳酸菌的增殖,加快了乳酸菌的發酵過程,迅速產生大量乳酸,使青貯的ｐＨ值很快下降,抑制了有害細菌的繁殖,避免了異常發酵,最終保證青貯質量。
3 葡萄糖氧化酶促生長的作用機理
3.1 消除腸道病原菌生存環境
保持腸道菌群生態平衡 葡萄糖氧化酶能催化腸道內的葡萄糖產生葡萄糖酸和過氧化氫,當過氧化氫積累到一定濃度時,直接抑制大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌的生長繁殖。其作用機理完全不同于抗生素,不會產生菌體抗藥性或藥物殘留。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖去除腸道內氧氣,為厭氧有益菌雙歧桿菌的增殖制造厭氧環境;生成的葡萄糖酸可降低胃腸內ｐＨ值為乳酸菌生長制造酸性環境。有益菌大量增殖形成微生態競爭優勢,不利于大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌存活,控制感染,排除腐敗物質,提高巨噬細胞活性,從而提高機體免疫力。
3.2 保護腸道上皮細胞完整
腸道上皮細胞保持高度的物理完整,可以阻擋大量病原體的侵入。畜禽處于應激狀態時,過多有氧化作用的“自由基”會破壞腸道上皮細胞,而葡萄糖氧化酶具有氧化作用,能清除自由基,保護腸道上皮細胞完整。
3.3 改善腸道酸性消化環境 葡萄糖氧化酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸,在腸道內發揮酸化劑的作用,創造酸性環境;降低胃中的ｐＨ值,激活胃蛋白酶,促進礦物質和維生素Ａ、Ｄ的吸收,并且酸性腸道環境可減少有害菌繁殖,預防腹瀉。葡萄糖氧化酶還能同時改善飼料的適口性,在動物出現拒食、厭食、消化不良、腹瀉時,添加葡萄糖氧化酶可以使動物迅速恢復正常采食。
3.4 解除腸道霉菌毒素中毒
葡萄糖氧化酶直接抑制黃曲霉、黑根霉、青霉等多種霉菌,對黃曲霉毒素Ｂ1中毒癥有很好的預防效果。高溫季節,飼料發霉產生的毒素會使動物肝腫大、胸腺萎縮、巨噬細胞受到毒害,進而導致免疫抑制。添加葡萄糖氧化酶則可防治這些癥狀。
4 葡萄糖氧化酶的制備提純方法
發酵法生產檸檬酸和葡萄糖酸的廢菌絲富含葡萄糖氧化酶,是工業生產葡萄糖氧化酶的理想資源。對工業廢菌絲的處理還可以減輕由其造成的環境污染。有研究表明,用葡萄糖酸發酵的工業廢菌絲生產葡萄糖氧化酶,通過有機溶劑沉淀聚乙二醇二次沉淀、羥基磷灰石柱色譜分離,可得到比活性超過190Ｕ/ｍｇ蛋白的產品-葡萄糖氧化酶。由于黑曲霉或青霉在產生葡萄糖氧化酶的同時還常伴有過氧化氫酶(主要)、α-淀粉酶、蔗糖酶和其他蛋白質的產生,因此有必要首先對葡萄糖氧化酶進行提純,以除去雜蛋白。常用純化方法如下:
4.1 沉淀法
選擇適宜沉淀劑濃度通過分級沉淀或一步沉淀可將葡萄糖氧化酶和其他蛋白質初步分開。沉淀操作需在低溫下進行,因為葡萄糖氧化酶在室溫下對某些沉淀劑不穩定易失活。
4.2 吸附法
吸附材料的吸附機理是在一定條件下,吸附材料的活性基團與葡萄糖氧化酶通過疏水相互作用而被吸附,然后通過改變緩沖液的濃度和ｐＨ值而改變吸附材料中活性基團的電離狀態使葡萄糖氧化酶與吸附劑解吸。
4.3 離子交換法
葡萄糖氧化酶的等電點在4 9左右,而過氧化氫酶的等電點在6 5附近。因此在提純葡萄糖氧化酶時應選用陰離子交換劑,且在ｐＨ值大于4 9時上樣和淋洗,此時葡萄糖氧化酶帶負電荷,可被陰離子交換劑吸附留柱,而過氧化氫酶帶正電荷隨淋洗液流下,從而使二者得以分離,最后用ｐＨ值小于4.2的緩沖液洗柱,使葡萄糖氧化酶帶正電荷而從柱上被洗脫。
5 結語
葡萄糖氧化酶不僅能夠代替抗菌藥物,而且還能代替抗球蟲藥物,是一種新型綠色飼料添加劑。隨著制備提純工藝的不斷發展完善,葡萄糖氧化酶將在飼料行業中發揮越來越重要的作用。
