摘要：酵母培養物（YC）作為飼料添加劑在反芻動物生產中應用較為廣泛。本文主要從其對瘤胃微生物區系的影響及作用機理，以及影響酵母作用效果的因素展開討論，為此方面研究提供一些理論基礎。
關鍵詞：YC；微生物區系；作用機理

MANIPULATION OF YEAST CULTURE TO MICROFLORA

LONG Ling，GONG Yue-sheng
（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Northwest
Sci-Tech University of Agriculture andForestry, Shannxi, 712100 China)

Abstract: Yeast culture (YC) is widely used as a feed additive for ruminants production. Researches indicate that YC can stimulate the growth of specific microorganisms in rumen, so as to improve animal production. It reviews the effect of YC on rumen microflora, the possible action mechanism, and the factors involved in the efficiency. Research progress and prospect on YC was discussed.
Key words: Yeast culture; Rumen microflora; Action mechanism

通過調控瘤胃微生物區系來加強反芻動物對粗飼料的利用近年來成為反芻動物學家和營養學家研究的熱點。目前存在許多方法用以調控瘤胃微生物區系，如應用離子載體和抗生素。但對于飼料工業中應用抗生素所引起的問題和尋求安全飼料的廣泛關注，促使研究者致力于發展一種新型非抗生素或“天然”的飼料添加劑。微生物飼料添加劑，即直接飼喂微生物（DFM），完全滿足發展需求，因而被推到了歷史前臺。DFM包括細菌、酵母（真菌）等，許多研究證明DFM使用效果良好，尤其是酵母培養物（Yeast Culture，YC）。
YC 是經嚴格控制條件的液體、固體二級發酵或直接在固體培養基發酵后連同培養基一起加工制得的產品，含有酵母菌及其賴以生長的培養基，以及酵母代謝產物。目前國內外制備YC的常用菌種為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）, 并常添加有米曲霉（Aspergillus oryzae）或其提取物以及乳酸桿菌（Lactobacillus）。
YC最初是用作刺激反芻動物瘤胃微生物的一種生長因子，主要通過酵母代謝產物和酵母菌的作用調節動物腸道或瘤胃內微生物平衡，刺激有益菌生長，防止疾病，提高動物生產性能。大多結果表明，YC對改善反芻動物瘤胃的微生物生態，刺激某些有益的細菌生長，促進動物生長和提高產奶量的作用較為明顯，而且對反芻動物的營養作用明顯優于單胃動物。
本文主要從YC對瘤胃微生物區系的影響及作用機理，影響酵母作用效果的因素，以及研究現狀和發展方向這幾方面作一淺述，以期為后續研究提供一些理論幫助。
1 YC對瘤胃微生物區系的影響
日糧中添加YC能選擇性刺激瘤胃特定微生物，改變微生物區系，使瘤胃內有益微生物濃度升高及活性加強，有利于粗纖維及其它營養物質的消化，以及破壞、降解能導致瘤胃失衡的代謝中間產物。
YC對反芻動物生產性能的影響主要是通過瘤胃內微生物菌群的變化起作用。添加YC的作用之一是通過培養一個健康并活力旺盛的纖維分解菌群而有助于提高纖維消化率。大量研究表明，日糧中添加YC能增大纖維分解菌濃度及增強其活性。

圖1 YC作用機制模型
Dawson（1990）報道，在以粗飼料為基礎日糧的培養基中添加YC使纖維分解菌濃度升高（P<0.05），進一步試驗證明，閹牛瘤胃中纖維分解菌濃度隨YC添加量的增加而增加[1]。添加YC也能提高飼喂高粗飼料奶牛瘤胃的纖維分解菌數量，但差異不顯著（Erasmus等，1992）[2]。Wiedmeier（1987）試驗發現，在非泌乳奶牛日糧中添加YC使纖維分解菌數量增加近40%（P<0.05），米曲霉發酵提取物使纖維分解菌數升高達27%（P<0.05）。反芻動物日糧或瘤胃模擬裝置中添加YC可穩定瘤胃環境，尤其是使pH值升高，這可用來解釋總厭氧菌和纖維分解菌濃度的升高
有些研究者認為，YC雖能刺激纖維分解菌數量的增長，但并不對纖維消化的程度發生影響。Newbold等（1991）發現，米曲霉和釀酒酵母增強了瘤胃微生物對纖維消化的速度，但不提高其對纖維消化的程度[3]。Callaway等（1997）報道，在含6g/l纖維二糖的培養基中加入釀酒酵母濾液，能刺激纖維分解菌（產琥珀酸擬桿菌S85、黃化瘤胃球菌FD1和白色瘤胃球菌B199）對纖維二糖的利用，但只是增加了產琥珀酸擬桿菌S85和黃化瘤胃球菌FD1對纖維消化的起始速率，并不影響消化度[4]。
營養物質在瘤胃內的迅速發酵所產生的大量有機酸導致瘤胃pH值的下降，過低的pH值會抑制瘤胃微生物的生長，降低動物對營養物質特別是粗纖維的利用，嚴重時導致瘤胃功能失調。瘤胃內pH值的適當升高，有利于瘤胃微生物的增殖，從而促進營養物質消化利用，尤其是瘤胃內氨氮的利用。研究發現，添加YC能促進乳酸利用菌的生長，維持瘤胃內環境的恒定。YC能刺激含乳酸培養基中乳酸利用菌的生長，給飼喂高能量的育肥牛補飼YC也能提高乳酸利用菌的濃度[7]。Linehan等（1978）向含有乳酸的培養基中加入0.5%酵母提取物，使反芻獸新月單胞菌HD4的生長提高了3.8倍，而在不含乳酸的培養基中加入酵母提取物，對其生長只有輕微促進作用，說明酵母能促進乳酸利用菌利用乳酸。并有報道表明在高精料日糧中補加酵母不但增加了乳酸利用菌的濃度，也加快了乳酸利用速率[8]。
米曲霉培養基濾液中的一些因素可以抑制乳酸的利用[4]。如葡萄糖是一種優先底物，抑制了反芻獸新月單胞菌對乳酸的利用。濾液中存在葡萄糖、乳酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸和天冬氨酸，即使反芻獸新月單胞菌利用乳酸過程中需要有機酸（如天冬氨酸和蘋果酸），葡萄糖同樣會抑制放射性標記的L-乳酸在短期內（5min）的利用，但埃氏巨球形菌（Megasphaera elsdenii）對乳酸的利用不受分解代謝物的阻抑。YC濾液雖抑制了乳酸的短期利用（5min），但卻能刺激反芻獸新月單胞菌和埃氏巨球形菌在含乳酸培養基中的長期生長（24h后）。
有關YC對蛋白分解菌及淀粉分界菌影響的報道并不多。但Yoon和Stern（1996）認為添加YC可能會提供某種因子刺激蛋白分解菌的生長[10]。Kumar等（1994）在水牛高精料日糧中添加釀酒酵母培養物，發現與對照組相比，淀粉分解菌的數量提高了近0.077%[11]。
活體試驗表明，19~28%的纖維分解酶活性是由原蟲產生的，但其消化僅局限于一些易受作用的組織，如葉肉細胞。研究證明去除原蟲會降低纖維消化率。由于原蟲離開細菌單獨生長比較困難，因此普遍認為原蟲在纖維消化中的作用比較微小。Frumholtz等（1989）研究發現，日糧中添加米曲霉使瘤胃原蟲數量減少了45%，因而解釋了為什么添加米曲霉能升高瘤胃菌數。原蟲數量的降低會使其捕食細菌的作用減弱，因而米曲霉能使更多的細菌生存。
添加YC降低原蟲數量或許不是YC的共性，正如許多研究中表明的，不同酵母制劑會對原蟲產生不定的影響[11，13，14]。由此判斷，酵母制劑的種類或許是影響酵母與原蟲之間相互作用的重要因素。如Oellermann等和Fonderila等（1990）研究發現，米曲霉對原蟲數量幾乎沒有影響[5，6]。也有人發現，YC能提高瘤胃中原蟲數量。Kumar（1994）報道，在水牛高精日糧中添加釀酒酵母培養物能使瘤胃原蟲數量提高0.079%[11]。盧慶萍（1999）試驗結果表明，閹牛日糧中添加YC使瘤胃原蟲數量提高了12.16%（P<0.05）。
Chaucheyras等（1995）報道，當向不含維生素的培養基中加入活性釀酒酵母后，能刺激厭氧真菌Neocallimatix frantalis MCH3的孢子產生纖維分解能力，使發酵產物如氫氣、甲酸、乙酸、乳酸等濃度升高，表明酵母能增強厭氧真菌對植物細胞壁的附著[15]。經活酵母刺激后，真菌在瘤胃內降解木質素?纖維素飼草的能力也提高了。米曲霉發酵提取物能刺激與真菌Neocallimatix frantalis MCH3形態相似的真菌Neocallimatix frantalis EB188的生長及纖維分解酶的產生。Prange等（1979）收集日糧中添加米曲霉的奶牛十二指腸內容物，發現飼料顆粒上附著大量與正常瘤胃真菌群形態相似的真菌，但在不添加米曲霉的奶牛瘤胃內容物中卻并未發現。
2 YC作用機理
到目前為止，研究者還未完全搞清YC對瘤胃微生物區系的作用機理，這仍然是個存在爭端的領域。但研究者已提出大量假設去闡述它，概括起來，共有以下幾個方面：
2.1 生長刺激因子
YC本身并不具有纖維分解活性，它的作用在于能為纖維分解菌提供一些可溶性生長刺激因子，如維生素B、氨基酸、有機酸、葡萄糖、支鏈揮發性脂肪酸或不明生長因子，來刺激瘤胃中利用乳酸和分解纖維的細菌生長。這些物質是某些瘤胃微生物生長、代謝所必需的。細菌純培養時，反芻獸新月單胞菌HD4在含L-乳酸的培養基中生長需要L-天冬氨酸、β-氨基苯甲酸和生物素的參與，其中天冬氨酸可用L-蘋果酸或延胡索酸代替[7，16]。但只有天冬氨酸、延胡索酸、蘋果酸，而缺乏乳酸的培養基不能刺激反芻獸新月單胞菌HD4的生長[16]。反芻獸新月單胞菌H18（一個新分離的瘤胃細菌）在乳酸中的生長也需要天冬氨酸[17]。
胰胨是含肽和支鏈氨基酸的酪素酶解產物，而酵母提取物是維生素B和其它不明生長因子的絕好來源。YC濾液提供的生長因子與在胰胨和酵母提取物中發現的生長因子相同，它們是反芻獸新月單胞菌和埃氏巨球形菌在乳酸培養基中生長所必需的[4]。
YC雖能刺激總厭氧菌及纖維分解菌濃度的升高，但經研究發現，提供同樣劑量的熱滅活YC（121℃，15min）卻不能刺激它們的增殖，說明YC的作用效果在很大程度上取決于酵母細胞在消化道內的代謝活性，發揮刺激作用的是活細胞或一些熱不穩定產物[1]。添加到瘤胃模擬裝置中的輻射滅活酵母仍能保持大部分刺激活性，而經高溫高壓滅活后，則喪失此活性[3，18]。這進一步說明YC刺激細菌生長的能力依賴于一種尚未知的熱不穩定因子，因而將不明生長因子稱為熱不穩定因子。經分析發現，這些因子的基本特性與一些具有生物活性的小肽的基本特征一致，而在隨后的瘤胃細菌培養中發現，小肽對其確有刺激活性，并且當濃度很低時，其刺激活性也很低，說明這些物質就是限制性營養因子，因此又有人將此機理稱為小肽營養代謝扳機理論。
2.2 除氧效應
瘤胃為一厭氧環境，但即使是非瘺管牛，其瘤胃內氧氣含量也占總氣體量的0.5~1.0%。氧氣對厭氧菌有害，能抑制瘤胃細菌生長及纖維分解菌對纖維的附著作用。酵母呼吸活動中需要消耗氧氣，因而保護瘤胃嚴格厭氧菌免受氧氣的破壞。Newbold等（1996）報道，將添加到瘤胃模擬裝置中能刺激總厭氧菌和纖維分解菌數量增加的釀酒酵母的兩種菌株NCYC240、NCYC1026和商業制劑Yea-Sacc以1.3mg/ml的濃度加入綿羊瘤胃液中，能將氧氣的消失速率提高46~89%。而對細菌數沒有影響的NCYC694和NCYC1088對氧氣的消失速率不發生影響。并且發現，經溴化乙錠誘變，導致呼吸功能缺陷的釀酒酵母突變株NCYC240和NCYC1026也不能刺激瘤胃模擬裝置中總厭氧菌及纖維分解菌的生長。

2.3 選擇性刺激效應
研究發現，YC對某些細菌具有選擇性，可刺激它們優先生長。添加YC刺激了可防止乳酸中毒的乳酸利用菌的優先生長[8]。釀酒酵母能刺激純培養環境中乳酸利用菌（反芻獸新月單胞菌）的優先生長，這顯然是因為酵母中的二羧酸促進了細菌對乳酸的利用[7]。YC選擇性刺激效應從甘露醇利用菌上得到進一步證實。以甘露醇為唯一碳源的培養基對于反芻獸新月單胞菌有選擇性刺激作用，取瘤胃液接種于該培養基上，其它細菌7天后才能生長。因此，目前研究中用在甘露醇培養基上生長的菌數來代表反芻獸新月單胞菌的數目。
2.4 自身效應
YC能產生多種酶類，如α-淀粉酶類、蛋白酶、纖維素酶和半纖維素酶等。瘤胃液中短鏈糖可能是α-淀粉酶對日糧谷物中淀粉作用的結果，而添加YC使這些糖濃度降低是引起乳酸下降的主要原因，因為一般認為日糧中添加糖和其它快速發酵飼料時會引起乳酸濃度的升高。經研究發現，米曲霉本身能產生纖維分解活性。雖然此項研究沒有觀察到影響纖維分解程度的條件，但米曲霉可能改善了細菌對稻草的附著和建群。米曲霉不能產生將結構性碳水化合物解聚成單糖的酶促機制，但它能引發酶發生部分解聚作用，在瘤胃纖維分解菌發揮解聚作用，將纖維性物質轉變成單糖的過程中起到輔助作用。米曲霉自身也存在蛋白水解活性。體外法研究結果表明，米曲霉能增大揮發性脂肪酸的濃度，表明米曲霉能促進更多的蛋白水解，因為支鏈VFA是蛋白水解產物。
3 影響酵母添加效果的因素
大量研究結果表明，YC的作用效果并不穩定，幾乎所有影響瘤胃環境及功能的因素都會對其產生影響，歸納后主要有以下幾個方面：酵母（菌株、活性、劑量及存放時間）、日糧（類型及水平）、動物（生理階段及生產水平）和飼養管理。
3.1 酵母
3.1.1 菌株
酵母菌株很多，美國國家菌株收集中心目前保存有1000多株生化或是基因特性不同的釀酒酵母屬酵母菌，再加上其它屬的菌種，應該說可以用作飼料添加劑的酵母菌種數量是很大的。許多研究者都在研究篩選區別不同酵母菌對促進瘤胃特殊微生物繁殖能力的大小，結果表明酵母菌株間對瘤胃微生物的影響存在明顯差異。可以認為，有關酵母產品作用效果的差異很大程度緣于所用菌株的差異。
Dawson和Hopkin（1991）的試驗測定了瘤胃微生物在純培養時和與特定酵母菌系協培養時的生長和活性，發現幾種酵母菌株可刺激纖維分解菌和乳酸利用菌的生長，而其它菌株的這種能力十分有限[20]。可見，酵母的作用與其菌系密切相關。Newbold等（1995）研究發現，釀酒酵母菌株NCYC240、NCYC1026和商業制劑Yea-Sacc能刺激瘤胃模擬裝置中總厭氧菌和纖維分解菌的生長，但NCYC694和NCYC1088無此功能。進一步的體內試驗證明，盡管NCYC240、NCYC1026和Yea-Sacc對綿羊瘤胃總厭氧菌和纖維分解菌有刺激作用，但只有NCYC1026對總厭氧菌和NCYC240對纖維分解菌的刺激作用達到顯著水平（P<0.05）[14]。
3.1.2 活性
YC的刺激作用可能與酵母細胞在瘤胃中的生長與代謝活性有關。YC作為一種飼料添加劑，其代謝活性比繁殖能力更為重要。研究顯示，經輻射而失去繁殖能力但仍具有代謝活性的酵母有促進瘤胃菌生長的能力[18]。研究發現，在39℃的瘤胃液中添加酵母，6h后仍然能保持代謝活性。
溫度和加熱時間可對YC代謝活性產生影響。Elizabeth（1994）通過測定酵母轉化葡萄糖為二氧化碳的數量研究了不同時間的干熱對酵母培養物代謝活性的影響（如表１所示）。

表１ 溫度和加熱時間對YC代謝活性（以產氣量表示）的影響

結果表明，在70℃的溫度下，不論加熱時間多長都不影響YC的代謝活性。80℃加熱5min其代謝活性為不加熱組的90%，15min 則為70%。90℃加熱15min活性只下降了60%。可見，在如此高的溫度下，YC代謝活性雖有所下降，但總的代謝活性并未完全喪失。
死酵母或失活酵母能否保持代謝活性報道不一。經熱鈍化的YC制劑對瘤胃細菌的生長沒有影響，這表明失活酵母喪失代謝活性[1]。在模擬瘤胃培養中進一步研究熱殺死和活酵母對纖維分解菌的作用時發現，酵母的刺激活性依賴于酵母活細胞的熱不穩定內容物。
3.1.3 劑量
隨米曲霉濃度升高，瘤胃厭氧真菌數量有增大的趨勢[6]。應用瘤胃模擬裝置研究發現，隨米曲霉添加劑量的增加甲烷產量呈降低趨勢。Besony等（1996）給泌乳中期奶牛補飼不同水平的酵母液態產品時發現，隨YC添加水平增加，乙酸比例降低，丙酸比例升高，乙:丙比值線形下降，乳脂率也隨之下降。由此可見，YC的添加劑量會對反芻動物產生不定的影響，應視具體情況添加。
3.2 日糧
大量研究結果表明，YC與日糧之間可能存在互作關系，YC改變發酵方式的能力主要隨日糧不同而異，日糧組成發生很小變化就會導致YC作用效果的較大變異。Spedding（1991）報道，飼喂添加YC的大麥日糧時閹牛日增重提高19%，而任意采食青貯料卻只提高6.7%。Edwards等（1991）發現添加YC時，飼喂青貯料比飼喂高纖維的農副產品和高比例的大麥效果更好。當奶牛飼喂60%的精料和40%的秸稈時，補加YC使產奶量提高了17.5%，但用青干草代替秸稈時只增加了14%[21]。Quinone等（1988）研究發現，當奶牛飼喂苜蓿干草和小麥時，YC能刺激產奶量的增加，但當小麥被玉米代替時則無此效果。基礎日糧類型影響YC的添加效果，而且似乎在高精料日糧的情況下，動物表現最大的生產反應[22]。Fallon（1987）報道，飼喂淀粉精料（高粱）基礎日糧能提高犢牛的增重和營養物質的消化率，而飼喂非淀粉精料日糧（玉米面筋）的犢牛則無效果。
YC作用效果的差異部分是由于日糧特點不同，尤其是快速發酵碳水化合物的水平不同。有資料表明，當NSC（非結構性碳水化合物）濃度低于日糧中DM總量的25%時，YC的添加效果不顯著，甚至會降低產奶量和飼料利用率。因為低NSC日糧缺乏足夠數量的代謝能來維持YC在瘤胃內的存活和發酵，所以有產奶量下降6.8%的報道。在低NSC日糧中，YC的作用效果隨日糧水平的升高而加強。當NSC濃度高于日糧DM總量的42.7%時，添加YC不但不能提高產奶量和飼料利用率，相反會有所下降。因為高谷物日糧能降低瘤胃內pH值，抑制瘤胃微生物活性，使YC失效。這就是Edwards（1991）用高水平日糧添加YC時，產奶量下降的原因，后來用青貯部分去代替大麥效果良好[23]。因而在高NSC日糧中，YC的作用效果隨日糧中青、粗飼料的增加而升高。當NSC濃度適中，在30.5~35.5%時，日糧中添加YC能顯著提高產奶量和飼料利用率。研究發現，當DM中NSC含量達38%時，添加效果最佳。Randy（1992）報道，奶牛日糧中NSC含量低于30%時，添加YC生產性能有所下降。因為反芻家畜瘤胃微生物需要充足的降解性輸入蛋白和NSC，才能產生較多的細菌蛋白來發揮YC的作用。
當日糧精:粗比增大時，特別是對易發酵碳水化合物含量高的日糧，添加YC對提高奶牛產奶量的效果更加明顯。隨著精料逐漸取代低水平混合日糧，YC提高生產性能的效果將更加顯著。Moloney（1994）采用高精料高質量日糧（CP172g/kgDM，CF357g/kgDM）進行試驗，結果表明添加YC的閹牛瘤胃pH值下降，乙酸與丙酸比值降低，揮發性脂肪酸濃度增高（P<0.001），與Chademana和Offer（1990）用綿羊試驗的結果一致，并且瘤胃氨濃度下降（P<0.05）[20]。而低精料低質量日糧組（CP104g/kgDM，CF646g/kgDM）上述指標不受影響，但蛋白消化率下降。
也有人認為，日糧營養水平越低，品質越差，添加酵母后日糧消化率提高幅度越大，使用效果越顯著。
總之，YC的作用效果不可一概而論，而取決于添加時的日糧水平，過高或過低都不利于YC作用的發揮。
3.3 動物
在動物生理敏感期添加YC效果較為明顯[2]。研究發現，YC對早中期泌乳牛的效果比晚期顯著，提高了4%脂肪校正乳產量及乳脂率，并可提高乳蛋白率，使泌乳高峰期提前。因此，應在動物處在生理敏感期時添加YC，以取得較顯著效果。Hoyos等（1987）試驗表明添加YC使高產奶牛產奶量增加（32.8VS30.9kg/天），但對低產奶牛（22.3kg/天）沒有影響；高產奶牛乳脂率增加了19.4%，低產奶牛僅增加14%[25]。由此可看出，生產水平不同會對YC的添加效果造成影響，添加前應搞清究竟在什么水平下YC能最大促進動物生產性能。

3.4 飼養管理
大量研究報道，奶牛粗飼料與精料分開飼喂時添加YC效果較為明顯。Zinn和Borquez（1993）研究發現，添加YC對限飼肉牛只有輕微的促進效果，對自由采食肉牛卻能提高瘤胃消化速率，增加瘤胃和全消化道有機物的消化率。添加YC時應注意給動物提供最適的飼養管理方式，發揮YC的最大效應。
4. 研究現狀及發展方向
4.1 研究現狀
目前對YC的研究多集中于生產應用水平及對瘤胃發酵、消化代謝和微生物區系影響的表觀水平。大多研究表明：添加YC能提高反芻動物生產性能，表現在提高采食量、增重、產奶量及改善乳組成；YC能改善瘤胃發酵，穩定瘤胃pH值，并能YC能提高DM、NDF、ADF、CP的瘤胃消化率及全消化道消化率；YC能刺激瘤胃細菌數量及活性的提高。
為確定飼料中所添加YC的適當數量，保證一定程度上可靠的促生產效果，同時保證對動物安全無害，迫切需要對YC產品中酵母菌系進行鑒定。研究表明，基因指紋技術是一種有效的方法，因為不同酵母菌種所含大量的備選指紋序列本身就表現出菌種間差異。目前使用的標記指紋的技術有TY（Transposable yeast，可變換Y）因子和PCR技術的隨機放大多態（RAPD）顯示技術。前者可用來成功的標記釀酒酵母菌系的指紋，后者可用以區分極為相似的酵母菌系。
4.2 發展方向
近幾年的研究結果證實，YC在許多不同的生產系統中對反芻動物的生長與生產性能都有顯著的影響，然而獲得最佳使用效果的適宜條件還不確定，今后的研究方向應集中于：（1）研究能夠最有效地刺激瘤胃特種微生物區系活性的酵母作用機制；（2）深入研究確定適于各種類型飼料和不同生產條件下的刺激瘤胃微生物活性的酵母類型，即酵母菌種類型與飼料類型的配伍性，選擇出能夠使家畜產生理想反應的酵母菌種；（3）加強YC產品有效性的檢測。除已有的基因指紋技術外，研究者還應致力于發展更快、更有效的檢測方法。