啤酒糟是啤酒釀造生產的主要廢棄物之一。據測定，鮮啤酒糟含水分79.25%、粗蛋白5.19%、粗脂肪1.86%、粗纖維1.41%、無氮浸出物11.51%、灰分0.78%[1]，其中無氮浸出物的主要成分是木聚糖。近年來，我國啤酒工業迅速發展，年產啤酒超過二千多萬噸，成為世界上第二大啤酒生產國，由此產生了約1 000萬噸的啤酒糟。啤酒糟中固形物含量一般為15%～20%，水分含量高，極易腐敗變質，給處理和綜合利用帶來很大問題。長期以來，大多數廠家主要是將濕糟作為粗飼料直接低價出售，其收益甚微；有少數廠家則是將濕糟直接排放，不僅造成嚴重的環境污染，還導致資源的浪費。為此，一些研究人員對啤酒糟的利用進行了探究，如從啤酒糟中提取膳食纖維，制備功能性乳酸發酵纖維飲料[2]；利用啤酒糟發酵生產蛋白飼料[3]；利用啤酒糟發酵生產復合氨基酸營養液等等。本研究則試圖采用誘變育種技術從保藏菌種中選育得到一株能以啤酒糟作為主要原料，添加其它輔料，進行固態發酵生產飼料添加劑——木聚糖酶的生產菌株。飼用木聚糖酶用于畜牧、養殖業，不僅為綜合開發利用啤酒糟這一再生資源開辟新途徑，還可有效避免啤酒糟對環境的污染。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 啤酒糟
取自湖北省啤酒學校啤酒廠。
1.1.2 木聚糖
美國sigma公司生產。
1.1.3 菌種
黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、假單胞菌均為湖北工學院再生資源利用課題組的保藏菌種。
1.1.4 斜面培養基
培養細菌：營養瓊脂。
培養真菌：蔗糖20（g/l）、酵母膏10（g/l）、蛋白胨10（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值自然。
1.1.5 初篩培養基
培養真菌：木聚糖10（g/l）、K2HPO4 0.7（g/l）、KH2PO4 0.7（g/l）、MgSO4 0.7（g/l）、 NH4NO3 1.0（g/l）、NaCl 0.005（g/l）、MnSO4 0.001（g/l）、ZnSO4 0.002（g/l）、FeSO4 0.002（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值自然。
培養細菌：木聚糖10（g/l）， K2HPO4 2.0（g/l）、NH4NO3 2.0（g/l）、酵母膏5.0（g/l）、MgSO4 0.2（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值7.2。
1.1.6 復篩培養基
啤酒糟：麩皮＝8：2；添加培養基干料1%的NH4NO3。
1.2 方法
1.2.1 菌種的活化
將菌種接入斜面培養基中，置適溫（細菌 37℃；真菌 30℃）下培養48～72h。
1.2.2 出發菌株的篩選
將保藏的斜面菌種經活化、分離純化后，點植于初篩平板培養基上，分別置適宜溫度條件下培養40～48h，測定菌落直徑和透明圈直徑，計算HC值。HC值＝透明圈直徑/菌落直徑，將HC值大的菌株（真菌），作為出發菌株，接入復篩培養基中，置30℃下培養后測酶活力。
1.2.3 菌種的誘變
1.2.3.1 誘變劑
①紫外線：30W紫外燈管，距離30cm，紫外燈預先開30min，以穩定光源。②LiCl：將20%LiCl溶液定量加入無菌平皿中，與培養基混勻制成LiCl平板。
1.2.3.2 誘變處理方法
（1） 單孢子懸浮液的制備
用無菌水洗下出發菌株的斜面孢子，置搖床上150r/min振蕩分散30min，經四層無菌鏡頭紙過濾，制成孢子濃度約為106個/ml的單孢子懸浮液。
（2） 誘變劑處理
①LiCl處理：將孢子懸浮液稀釋后涂于LiCl平板上。②紫外線處理：預熱紫外燈30min后，取濃度為106~107個/ml的孢子懸液，注入Ф9cm的無菌培養皿中（5ml/皿），置紫外燈下照射處理一定時間。
1.2.4 突變菌株的分離篩選
1.2.4.1 初篩
將經誘變處理過的孢子懸浮液適當稀釋后涂布于初篩平板上，30℃恒溫培養48h后，計算存活率并挑取透明圈較大的變異菌株接入斜面培養基。
存活率（%）＝誘變處理后的存活菌數/未誘變處理的活菌數×100%
1.2.4.2 復篩
將突變菌株接入復篩培養基中，30℃條件下培養64～68h，得到固態發酵培養物，測定其酶活力。
1.2.5 酶活力測定
1.2.5.1 酶液的制備
稱取固態發酵培養物5g,加入自來水100ml，在40℃下浸提1h，過濾，濾液即為酶液。
1.2.5.2 木聚糖酶活力測定[4]
取0.1ml適當稀釋的粗酶液和用pH值4.6醋酸緩沖液配制的1%木聚糖懸浮液0.9ml置于試管中，40℃水浴保溫10min后加入2.0ml DNS試劑，沸水浴3min。用3，5二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）測定還原糖（以木糖計），以100℃滅活粗酶液作對照。酶活力單位定義為：每分鐘水解木聚糖形成相當于1μmol木糖的還原糖所需的酶量（IU/g）。
木聚糖酶活單位＝NG/150.13/0.1×10/干曲重〔μmol木糖/（g干曲·min·40℃）〕
式中：N——酶液稀釋倍數；
G——酶解液中木糖的含量（μg）；
150.13——木糖分子量；
0.1——加酶量（ml）；
10——酶解時間（min）。
2 結果與分析
2.1 出發菌株的篩選
據文獻[5-8]報道，黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉等真菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、假單胞菌等細菌中的某些菌種可產木聚糖酶。故而從課題組所保藏的菌種中挑出這些真菌和細菌，試圖從中篩選木聚糖酶高產菌株。
以木聚糖為唯一碳源的平板培養基培養菌株。從40株保藏菌株中得到15株生長快，HC值＞1.2的菌株（米曲霉和黑曲霉），將其接入復篩培養基中進行固態發酵培養，測定木聚糖酶活力，結果見表1。
由表1比較可見：①HC值與固態發酵酶活力并不一定呈正相關，這可能與培養基質等培養條件改變有關，也與不同菌株所具有的木聚糖酶的酶學性質不一致有關；②An27的酶活力明顯高于其它菌株，在復篩培養基中培養65h酶活可達216.611 IU/g。因而選An27作為出發菌株。
2.2 產酶菌株的誘變
為了進一步提高菌株的產酶能力，采用紫外線、LiCl分別對An27進行誘變處理。誘變處理量孢子存活的關系見圖1，圖2。
由圖1、圖2可見，隨著誘變處理量的增加致死率提高，存活率下降。
2.3 突變株的篩選
從初篩平板上挑取透明圈較大的菌株進行斜面傳代接種，固態發酵復篩，結果見圖3。
由圖3可見，1～4號菌株的木聚糖酶活力較高。
2.4 突變株的傳代穩定性試驗
將篩選出的4株菌進行多次斜面傳代接種，并于斜面傳代接種后，接種于復篩培養基中固態發酵培養，測各菌株的木聚糖酶活（見表2）。
綜合比較表2中數據，可見An27-3不僅木聚糖酶活力較高，而且產酶性能較穩定。
3 小結
將從保藏菌種中篩選的黑曲霉An27作為出發菌株進行誘變育種處理，再從突變菌株中篩選到一株能發酵啤酒糟高產木聚糖酶的菌株——An27-3。
在以啤酒糟為主要原料的固體基質上，30℃條件下培養64～68h, 黑曲霉An27的木聚糖酶活為每克干曲216.611 IU，而黑曲霉An27-3的酶活為每克干曲283.362IU，比出發菌株提高30.82%。經傳代試驗證明An27-3的產酶性狀較穩定。通過進一步優化其發酵條件可在飼用酶制劑生產中有良好的應用前景。
飼料工業
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 啤酒糟
取自湖北省啤酒學校啤酒廠。
1.1.2 木聚糖
美國sigma公司生產。
1.1.3 菌種
黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉、嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、假單胞菌均為湖北工學院再生資源利用課題組的保藏菌種。
1.1.4 斜面培養基
培養細菌：營養瓊脂。
培養真菌：蔗糖20（g/l）、酵母膏10（g/l）、蛋白胨10（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值自然。
1.1.5 初篩培養基
培養真菌：木聚糖10（g/l）、K2HPO4 0.7（g/l）、KH2PO4 0.7（g/l）、MgSO4 0.7（g/l）、 NH4NO3 1.0（g/l）、NaCl 0.005（g/l）、MnSO4 0.001（g/l）、ZnSO4 0.002（g/l）、FeSO4 0.002（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值自然。
培養細菌：木聚糖10（g/l）， K2HPO4 2.0（g/l）、NH4NO3 2.0（g/l）、酵母膏5.0（g/l）、MgSO4 0.2（g/l）、瓊脂20（g/l），pH值7.2。
1.1.6 復篩培養基
啤酒糟：麩皮＝8：2；添加培養基干料1%的NH4NO3。
1.2 方法
1.2.1 菌種的活化
將菌種接入斜面培養基中，置適溫（細菌 37℃；真菌 30℃）下培養48～72h。
1.2.2 出發菌株的篩選
將保藏的斜面菌種經活化、分離純化后，點植于初篩平板培養基上，分別置適宜溫度條件下培養40～48h，測定菌落直徑和透明圈直徑，計算HC值。HC值＝透明圈直徑/菌落直徑，將HC值大的菌株（真菌），作為出發菌株，接入復篩培養基中，置30℃下培養后測酶活力。
1.2.3 菌種的誘變
1.2.3.1 誘變劑
①紫外線：30W紫外燈管，距離30cm，紫外燈預先開30min，以穩定光源。②LiCl：將20%LiCl溶液定量加入無菌平皿中，與培養基混勻制成LiCl平板。
1.2.3.2 誘變處理方法
（1） 單孢子懸浮液的制備
用無菌水洗下出發菌株的斜面孢子，置搖床上150r/min振蕩分散30min，經四層無菌鏡頭紙過濾，制成孢子濃度約為106個/ml的單孢子懸浮液。
（2） 誘變劑處理
①LiCl處理：將孢子懸浮液稀釋后涂于LiCl平板上。②紫外線處理：預熱紫外燈30min后，取濃度為106~107個/ml的孢子懸液，注入Ф9cm的無菌培養皿中（5ml/皿），置紫外燈下照射處理一定時間。
1.2.4 突變菌株的分離篩選
1.2.4.1 初篩
將經誘變處理過的孢子懸浮液適當稀釋后涂布于初篩平板上，30℃恒溫培養48h后，計算存活率并挑取透明圈較大的變異菌株接入斜面培養基。
存活率（%）＝誘變處理后的存活菌數/未誘變處理的活菌數×100%
1.2.4.2 復篩
將突變菌株接入復篩培養基中，30℃條件下培養64～68h，得到固態發酵培養物，測定其酶活力。
1.2.5 酶活力測定
1.2.5.1 酶液的制備
稱取固態發酵培養物5g,加入自來水100ml，在40℃下浸提1h，過濾，濾液即為酶液。
1.2.5.2 木聚糖酶活力測定[4]
取0.1ml適當稀釋的粗酶液和用pH值4.6醋酸緩沖液配制的1%木聚糖懸浮液0.9ml置于試管中，40℃水浴保溫10min后加入2.0ml DNS試劑，沸水浴3min。用3，5二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）測定還原糖（以木糖計），以100℃滅活粗酶液作對照。酶活力單位定義為：每分鐘水解木聚糖形成相當于1μmol木糖的還原糖所需的酶量（IU/g）。
木聚糖酶活單位＝NG/150.13/0.1×10/干曲重〔μmol木糖/（g干曲·min·40℃）〕
式中：N——酶液稀釋倍數；
G——酶解液中木糖的含量（μg）；
150.13——木糖分子量；
0.1——加酶量（ml）；
10——酶解時間（min）。
2 結果與分析
2.1 出發菌株的篩選
據文獻[5-8]報道，黑曲霉、米曲霉、青霉、木霉等真菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、假單胞菌等細菌中的某些菌種可產木聚糖酶。故而從課題組所保藏的菌種中挑出這些真菌和細菌，試圖從中篩選木聚糖酶高產菌株。
以木聚糖為唯一碳源的平板培養基培養菌株。從40株保藏菌株中得到15株生長快，HC值＞1.2的菌株（米曲霉和黑曲霉），將其接入復篩培養基中進行固態發酵培養，測定木聚糖酶活力，結果見表1。
由表1比較可見：①HC值與固態發酵酶活力并不一定呈正相關，這可能與培養基質等培養條件改變有關，也與不同菌株所具有的木聚糖酶的酶學性質不一致有關；②An27的酶活力明顯高于其它菌株，在復篩培養基中培養65h酶活可達216.611 IU/g。因而選An27作為出發菌株。
2.2 產酶菌株的誘變
為了進一步提高菌株的產酶能力，采用紫外線、LiCl分別對An27進行誘變處理。誘變處理量孢子存活的關系見圖1，圖2。
由圖1、圖2可見，隨著誘變處理量的增加致死率提高，存活率下降。
2.3 突變株的篩選
從初篩平板上挑取透明圈較大的菌株進行斜面傳代接種，固態發酵復篩，結果見圖3。
由圖3可見，1～4號菌株的木聚糖酶活力較高。
2.4 突變株的傳代穩定性試驗
將篩選出的4株菌進行多次斜面傳代接種，并于斜面傳代接種后，接種于復篩培養基中固態發酵培養，測各菌株的木聚糖酶活（見表2）。
綜合比較表2中數據，可見An27-3不僅木聚糖酶活力較高，而且產酶性能較穩定。
3 小結
將從保藏菌種中篩選的黑曲霉An27作為出發菌株進行誘變育種處理，再從突變菌株中篩選到一株能發酵啤酒糟高產木聚糖酶的菌株——An27-3。
在以啤酒糟為主要原料的固體基質上，30℃條件下培養64～68h, 黑曲霉An27的木聚糖酶活為每克干曲216.611 IU，而黑曲霉An27-3的酶活為每克干曲283.362IU，比出發菌株提高30.82%。經傳代試驗證明An27-3的產酶性狀較穩定。通過進一步優化其發酵條件可在飼用酶制劑生產中有良好的應用前景。
飼料工業
