飼用酶制劑的開發和應用是生物技術在動物營養和飼料工業中應用最為成功的例子。它在提高動物生產性能和飼料利用效率，開發新的飼料資源，生產無毒、無殘留、天然的畜產品以及環境保護等方面逐漸顯示出巨大的潛力。以前，在反芻動物飼養中的應用酶制劑研究很少，因為人們認為瘤胃內的微生物活動很多，可分泌大量的酶，而且認為外源酶在瘤胃中被蛋白酶所水解或受小腸蛋白酶的作用而失活。最近研究發現纖維素酶、半纖維素酶在蛋白酶溫育的過程中相當穩定；木聚糖酶可抵抗數種蛋白酶的水解[1]。這再次引起了在反芻動物日糧中添加復合酶的興趣。另外，隨著生物工程技術的發展，給酶制劑生產領域帶來了新的發展機遇，一些酶制劑的活力和產量有所提高，酶制劑的穩定性和可用性隨之提高，這些有利因素使得酶制劑在反芻動物日糧中的應用成為可能。為此進行反芻動物酶制劑適宜配比及添加量的研究，旨在篩選出適宜的酶配方及添加量，應用于反芻動物生產中。
1 材料和方法
1.1 試驗設計
試驗一、根據目前反芻動物酶制劑應用研究進展，確定纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等5種單一酶作為酶制劑配比的原料，每種酶設高、低兩個水平，按正交試驗設計，即采用L8（27）正交表[2]，總共分A、B、C、D、E、F、G、H等8個配比組合，另設一個對照組（T）（即不加任何酶制劑），每個組合設3個平行樣。具體設計見表1。
試驗二、根據試驗一得出的結果，按照單因子設計，將最佳酶配比組合設6個水平（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），即設6個試驗組，另設一個對照組（不加任何酶），每一個組設3個平行樣。
1.2 試驗方法
采用體外批次培養法，培養時間為24h，在體外 批次培養飼料條件下，研究5種酶的8種不同組合對體外瘤胃微生物發酵的影響。具體試驗方法：先按正交試驗設計中的酶水平配制各個酶組合，再按0.1%酶制劑與體外批次培養飼料混勻，一起裝進培養瓶內，然后加20ml瘤胃液和40ml緩沖液，在體外培養裝置中進行振蕩培養。體外批次培養飼料配方見表2（體外批次培養裝置、緩沖液配制參見楊永明碩士論文[3]）。本日糧配方精粗比為3：7，為玉米—豆粕—青干草型日糧。
1.3 瘤胃液供體羊及飼養管理
選取4只健康的帶有永久性瘤胃瘺管的內蒙古半細毛羯羊。試驗動物在7：00和19：00分兩次飼喂，定量飼喂，日喂量900g。試驗前驅蟲，單籠飼養，自由飲水，自由光照。
1.4 瘤胃液供體羊日糧
1.5 試驗酶制劑及其酶活
試驗所用的5種酶（纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶）均由廣東溢多利生物科技有限公司提供，各酶的酶活按溢多利公司提供的企業標準方法測定，酶活見表4。
1.6 瘤胃液的采集
早晨飼喂后2h從4頭瘤胃液供體羊采集瘤胃液，將其灌入經39℃預熱、并通有CO2的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴瓶口，迅速返回實驗室。厭氧條件下經4層紗布過濾，持續充入CO2氣體5min，然后迅速分裝至上述已預熱的厭氧培養瓶內，每個培養瓶加入瘤胃液20ml，進行培養。
1.7 測定指標與測定方法
1.7.1 揮發性脂肪酸（VFA）
用日本島津GC-7A氣相色譜儀內標法進行測定。內標物為巴豆酸。測定過程為：取雙層紗布過濾后的培養液10ml，在3 500r/min條件下離心15min，取4ml上清液，加入1ml 25%偏磷酸（質量：體積），搖勻靜置30min以上（假如不能立即測定，應置于冰箱中低溫保存），取該混合液1ml加入預先裝有2g酸性吸附劑（酸性吸附劑：每100g酸性吸附劑含無水硫酸鈉60g，50%硫酸2ml，硅藻土40g。）的離心管內，再加入4ml巴豆酸溶液（31.25mM/l，溶劑為CHCl3），搖勻，澄清后，取1ml上機測定。
色譜條件:色譜柱內徑為3mm,長2m的不銹鋼柱，柱溫150℃，汽化室溫為230℃，擔體為Chromsob W(AW)（酸性硅藻土）重量10%的FFAP（聚乙醇與2-硝基對苯二甲基的反應物）與1%的H3PO4（優級醇）。空氣壓力為0.35kg/cm2，流量為140ml/min；氫氣壓力為1.2kg/cm2，流量為14ml/min；氮氣壓力為1.75kg/cm2，流量為55ml/min。進樣量為1μl。
1.7.2 中性洗滌纖維（NDF）
培養完畢后，將培養瓶內的內容物全部轉移到離心管內，在3 500r/min、15min的前提下離心，離心完畢后將上清液倒去，將下層沉積物轉移到小瓷碗中60～65℃烘至恒重待測。NDF的測定方法按照楊勝主編的《飼料分析與飼料質量檢測技術》（1991）進行。
1.8 數據統計與分析
試驗數據統計和分析利用SAS（8.0）軟件包中的ANOVA和DUNCAN程序進行。
2 結果與分析
2.1 不同酶制劑配比組合對NDF和VFA 的影響
試驗結果見表5。從表5的試驗結果可知：試驗各組合的VFA產量與對照組相比，除G、H組有顯著降低（P<0.05）外，其余各組都有一定的提高，但差異均不顯著（P>0.05），但H組與B、C組有顯著差異（P<0.05）。總的來看以試驗組合B和C的VFA產量最高；各組合的NDF含量較對照組均有一定的降低，但只有組合C、D與對照組差異顯著（P<0.05），C組合NDF最低且與對照組差異極顯著（P<0.01）。
因此，根據VFA產量與NDF降低結果判斷，組合C為最佳組合。即“纖維素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”為最佳組合。
2.2 不同水平酶制劑對NDF和VFA的影響
從表6的試驗結果可知：試驗各水平的VFA產量與對照組相比有增高的趨勢，但各組之間差異不顯著，但以0.2%水平組產量最高；試驗各水平的NDF含量較對照組均有顯著降低，且以0.2%水平組含量最低。
因此，根據VFA產量和NDF降低結果，0.2%水平組為最佳添加量。
3 討論
由于瘤胃內微生物能產生大量的纖維素酶，足可以保證纖維素降解需要，所以在所有的組合中，高水平纖維素酶的組合如E、F、G、H對NDF的降解都不理想。而添加高水平的木聚糖酶組合C、D、G對NDF的降解率較高，這可能是瘤胃微生物產生的木聚糖酶不足，適當添加木聚糖酶可提高NDF的降解。就單個高水平的酶對VFA的影響，很難得出規律，但就組合而言，以組合B、C的VFA產量最高，這是各種酶與酶之間組合效應綜合作用的結果。目前，一些酶組合研究結果表明恰當的酶組合是發揮酶最大功效的關鍵因素。朱元招等[4]（2001）在補飼不同配方酶制劑對犢牛斷奶后生產性能的影響試驗中，添加兩種不同配方的酶制劑，酶制劑E1由纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶組成，E2由木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶組成，兩組酶配方中，以纖維素酶為主的E1效果優于E2。Malathi和Devegowda（2001）[5]用體外法研究了3種復合酶：復合酶1（戊聚糖酶+纖維素酶）、復合酶2（戊聚糖酶+纖維素酶+β-葡聚糖酶）、復合酶3（戊聚糖酶+纖維素酶+β-葡聚糖酶+果膠酶）對玉米、高粱、小米、米糠、豆粕、花生餅、太陽瓜子餅和菜籽餅等飼料原料溶液的粘度及總糖的釋放量，研究表明，復合酶3使各種原料在體外的消化率達到最高。本試驗首次通過體外培養試驗對纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等5種進行篩選出“纖維素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”為最佳組合，并在此基礎上得出了適宜的添加量。這對研制應用于反芻動物適宜的復合酶制劑具有參考價值。誠然，體外條件與體內條件差別較大，體外法得出的最佳酶組合及添加量不能反映體內的真實情況。今后還需要進行體內試驗。只有用體內與體外結合的方法，才能得出科學的適用于反芻動物的復合酶制劑。
1 材料和方法
1.1 試驗設計
試驗一、根據目前反芻動物酶制劑應用研究進展，確定纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶等5種單一酶作為酶制劑配比的原料，每種酶設高、低兩個水平，按正交試驗設計，即采用L8（27）正交表[2]，總共分A、B、C、D、E、F、G、H等8個配比組合，另設一個對照組（T）（即不加任何酶制劑），每個組合設3個平行樣。具體設計見表1。
試驗二、根據試驗一得出的結果，按照單因子設計，將最佳酶配比組合設6個水平（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%），即設6個試驗組，另設一個對照組（不加任何酶），每一個組設3個平行樣。
1.2 試驗方法
采用體外批次培養法，培養時間為24h，在體外 批次培養飼料條件下，研究5種酶的8種不同組合對體外瘤胃微生物發酵的影響。具體試驗方法：先按正交試驗設計中的酶水平配制各個酶組合，再按0.1%酶制劑與體外批次培養飼料混勻，一起裝進培養瓶內，然后加20ml瘤胃液和40ml緩沖液，在體外培養裝置中進行振蕩培養。體外批次培養飼料配方見表2（體外批次培養裝置、緩沖液配制參見楊永明碩士論文[3]）。本日糧配方精粗比為3：7，為玉米—豆粕—青干草型日糧。
1.3 瘤胃液供體羊及飼養管理
選取4只健康的帶有永久性瘤胃瘺管的內蒙古半細毛羯羊。試驗動物在7：00和19：00分兩次飼喂，定量飼喂，日喂量900g。試驗前驅蟲，單籠飼養，自由飲水，自由光照。
1.4 瘤胃液供體羊日糧
1.5 試驗酶制劑及其酶活
試驗所用的5種酶（纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶）均由廣東溢多利生物科技有限公司提供，各酶的酶活按溢多利公司提供的企業標準方法測定，酶活見表4。
1.6 瘤胃液的采集
早晨飼喂后2h從4頭瘤胃液供體羊采集瘤胃液，將其灌入經39℃預熱、并通有CO2的保溫瓶中，灌滿后立即蓋嚴瓶口，迅速返回實驗室。厭氧條件下經4層紗布過濾，持續充入CO2氣體5min，然后迅速分裝至上述已預熱的厭氧培養瓶內，每個培養瓶加入瘤胃液20ml，進行培養。
1.7 測定指標與測定方法
1.7.1 揮發性脂肪酸（VFA）
用日本島津GC-7A氣相色譜儀內標法進行測定。內標物為巴豆酸。測定過程為：取雙層紗布過濾后的培養液10ml，在3 500r/min條件下離心15min，取4ml上清液，加入1ml 25%偏磷酸（質量：體積），搖勻靜置30min以上（假如不能立即測定，應置于冰箱中低溫保存），取該混合液1ml加入預先裝有2g酸性吸附劑（酸性吸附劑：每100g酸性吸附劑含無水硫酸鈉60g，50%硫酸2ml，硅藻土40g。）的離心管內，再加入4ml巴豆酸溶液（31.25mM/l，溶劑為CHCl3），搖勻，澄清后，取1ml上機測定。
色譜條件:色譜柱內徑為3mm,長2m的不銹鋼柱，柱溫150℃，汽化室溫為230℃，擔體為Chromsob W(AW)（酸性硅藻土）重量10%的FFAP（聚乙醇與2-硝基對苯二甲基的反應物）與1%的H3PO4（優級醇）。空氣壓力為0.35kg/cm2，流量為140ml/min；氫氣壓力為1.2kg/cm2，流量為14ml/min；氮氣壓力為1.75kg/cm2，流量為55ml/min。進樣量為1μl。
1.7.2 中性洗滌纖維（NDF）
培養完畢后，將培養瓶內的內容物全部轉移到離心管內，在3 500r/min、15min的前提下離心，離心完畢后將上清液倒去，將下層沉積物轉移到小瓷碗中60～65℃烘至恒重待測。NDF的測定方法按照楊勝主編的《飼料分析與飼料質量檢測技術》（1991）進行。
1.8 數據統計與分析
試驗數據統計和分析利用SAS（8.0）軟件包中的ANOVA和DUNCAN程序進行。
2 結果與分析
2.1 不同酶制劑配比組合對NDF和VFA 的影響
試驗結果見表5。從表5的試驗結果可知：試驗各組合的VFA產量與對照組相比，除G、H組有顯著降低（P<0.05）外，其余各組都有一定的提高，但差異均不顯著（P>0.05），但H組與B、C組有顯著差異（P<0.05）。總的來看以試驗組合B和C的VFA產量最高；各組合的NDF含量較對照組均有一定的降低，但只有組合C、D與對照組差異顯著（P<0.05），C組合NDF最低且與對照組差異極顯著（P<0.01）。
因此，根據VFA產量與NDF降低結果判斷，組合C為最佳組合。即“纖維素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”為最佳組合。
2.2 不同水平酶制劑對NDF和VFA的影響
從表6的試驗結果可知：試驗各水平的VFA產量與對照組相比有增高的趨勢，但各組之間差異不顯著，但以0.2%水平組產量最高；試驗各水平的NDF含量較對照組均有顯著降低，且以0.2%水平組含量最低。
因此，根據VFA產量和NDF降低結果，0.2%水平組為最佳添加量。
3 討論
由于瘤胃內微生物能產生大量的纖維素酶，足可以保證纖維素降解需要，所以在所有的組合中，高水平纖維素酶的組合如E、F、G、H對NDF的降解都不理想。而添加高水平的木聚糖酶組合C、D、G對NDF的降解率較高，這可能是瘤胃微生物產生的木聚糖酶不足，適當添加木聚糖酶可提高NDF的降解。就單個高水平的酶對VFA的影響，很難得出規律，但就組合而言，以組合B、C的VFA產量最高，這是各種酶與酶之間組合效應綜合作用的結果。目前，一些酶組合研究結果表明恰當的酶組合是發揮酶最大功效的關鍵因素。朱元招等[4]（2001）在補飼不同配方酶制劑對犢牛斷奶后生產性能的影響試驗中，添加兩種不同配方的酶制劑，酶制劑E1由纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶組成，E2由木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶組成，兩組酶配方中，以纖維素酶為主的E1效果優于E2。Malathi和Devegowda（2001）[5]用體外法研究了3種復合酶：復合酶1（戊聚糖酶+纖維素酶）、復合酶2（戊聚糖酶+纖維素酶+β-葡聚糖酶）、復合酶3（戊聚糖酶+纖維素酶+β-葡聚糖酶+果膠酶）對玉米、高粱、小米、米糠、豆粕、花生餅、太陽瓜子餅和菜籽餅等飼料原料溶液的粘度及總糖的釋放量，研究表明，復合酶3使各種原料在體外的消化率達到最高。本試驗首次通過體外培養試驗對纖維素酶、木聚糖酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等5種進行篩選出“纖維素酶：木聚糖酶：酸性蛋白酶：中性蛋白酶：α-淀粉酶=低：高：高：低：高”為最佳組合，并在此基礎上得出了適宜的添加量。這對研制應用于反芻動物適宜的復合酶制劑具有參考價值。誠然，體外條件與體內條件差別較大，體外法得出的最佳酶組合及添加量不能反映體內的真實情況。今后還需要進行體內試驗。只有用體內與體外結合的方法，才能得出科學的適用于反芻動物的復合酶制劑。
