1.前言

    纖維素酶是飼料用酶制劑中的常用酶種之一，可水解高分子的纖維素形成還原糖，因此可以用作飼料添加劑，來提高飼料的消化利用率。

由于各酶種在保存或飼料制粒高溫處理過程中會(huì)有一定程度的失活現(xiàn)象，為了比較微丸型及粉狀纖維素酶兩種劑型的貯存穩(wěn)定性及耐熱性能，我們進(jìn)行了同種纖維素酶的兩種劑型樣品在不同溫度條件下的耐熱性能，以及微丸酶在4%豬用預(yù)混料中的貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，以期為公司微丸型纖維素酶的研制及市場(chǎng)推廣作好準(zhǔn)備。

2．材料與方法

2．1 實(shí)驗(yàn)儀器

精密pH計(jì)：±0.01pH；

電子天平：d=1mg；

紫外分光光度計(jì)UV-1601（日本島津）；

烘箱；

恒溫水浴鍋；

2．2 實(shí)驗(yàn)試劑

磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.8）；

DNS試劑；

10mg/ml CMC-Na溶液；

1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。

2．3 實(shí)驗(yàn)材料

A：微丸型纖維素酶（溢多利公司生產(chǎn)）；

B：粉狀纖維素酶（市售產(chǎn)品）；

4%豬用預(yù)混料料：（16%；磷：7%；食鹽：7%；銅：6000ppm；鐵：3500ppm；鋅：4000ppm；氯化膽堿：2%；酸化劑：0.2%）

2．4 酶活測(cè)定

酶活力測(cè)定： 采用DNS法

酶活單位定義：在40℃，pH4.8條件下，每小時(shí)催化CMC-Na底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（μmol/hr）。

測(cè)定底物：10mg/ml CMC-Na溶液

酶液制備：分別準(zhǔn)確稱取1.000g樣品酶制劑，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液定容至500mL，搖勻，靜置提取，過濾后得到該纖維素酶提取液，然后稀釋適當(dāng)倍數(shù)備用。

DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取經(jīng)105℃烘干至恒重的無水葡萄（AR）1.0000克，配成10mg/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液。分別吸取10mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸餾水制成每毫升分別含有葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的標(biāo)準(zhǔn)液。各取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液0.5ml于試管中，加磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液1.5ml，DNS試劑3 ml于沸水浴中沸騰7min，取出后立即加入蒸餾水10ml混勻，冷卻后，于紫外分光光度計(jì)550nm處比色，以所得的光密度OD值為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的葡萄糖量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

空白的制作：以0.5ml蒸餾水代替0.5ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。

3． 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3．1 耐熱性對(duì)比研究

3．1．1處理時(shí)間相同（10min），處理溫度不同

1．每種樣品按處理溫度70℃、80℃、90℃、100℃不同分別稱取1.0g，并按 1：1的比例分別添加1.0g淀粉；

2．加水至樣品混合物的總濕度為17%，然后將各樣品按溫度不同進(jìn)行處理，時(shí)間均為10min，處理完后迅速冷卻至室溫；

3．測(cè)定處理后樣品的剩余酶活力；

4．以未經(jīng)處理的樣品酶活力為100%，其余經(jīng)過處理的酶活力與之相比得到的百分比即為該酶的相對(duì)剩余酶活力；

3．1．2處理溫度相同（85℃），處理時(shí)間不同

1．每種樣品按處理時(shí)間2.5、5.0、7.5、10min不同分別稱取1.0g，并按 1：1的比例分別添加1.0g淀粉；

2．加水至樣品混合物的總濕度為17%，然后將各樣品按時(shí)間不同進(jìn)行處理，處理溫度均為85℃，處理完后迅速冷卻至室溫；

3．測(cè)定處理后樣品的剩余酶活力；

4．以未經(jīng)處理的樣品酶活力為100%，其余經(jīng)過處理的酶活力與之相比得到的百分比即為該酶的剩余相對(duì)酶活力；

3．2 貯存穩(wěn)定性研究

1、將微丸型纖維素酶按1：1的比例同4%豬用預(yù)混料（含酸化劑、膽堿以及高濃度的微量元素）混合均勻，并分裝好置于貯藏室在室溫條件下貯存；

2、按周期取樣進(jìn)行測(cè)定，并將微丸酶過篩除去預(yù)混料后進(jìn)行酶活力測(cè)定。

3、以初始酶活為100%，其余與之相比所得百分比即為相對(duì)剩余酶活力。

4．實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4．1 水分含量測(cè)定

表1.樣品酶水分含量測(cè)定結(jié)果

4．2 耐熱性對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4．2．1 處理時(shí)間相同（10min），處理溫度不同

表2. 微丸酶及粉狀酶隨溫度變化的情況

由圖表結(jié)果可以看出，微丸型纖維素酶同粉狀酶相比，在溫度不超過70℃時(shí)，耐熱性能沒有多大差別，但當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，微丸酶的耐熱性能要優(yōu)于粉狀酶制劑。因此在飼料制粒過程中（溫度為85℃左右），微丸酶同粉狀酶制劑相比酶活損失更小。

4．2．2處理溫度相同（85℃），處理時(shí)間不同

                                  表3. 微丸酶及粉狀酶隨處理時(shí)間變化的情況

自圖表中的結(jié)果可以看出，在處理溫度不變，處理時(shí)間變化的條件下，微丸型纖維素酶同粉狀酶相比，耐熱性能有一定程度的提高。

4．3 貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)貯存于4%豬用預(yù)混料中的微丸型纖維素酶按周期進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示：

表4.微丸酶與粉狀酶貯存穩(wěn)定性對(duì)比

對(duì)貯存穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，微丸型纖維素酶在4%豬用預(yù)混料中貯存8周后，其相對(duì)剩余酶活力總體是圍繞95%~97%的軸線上下波動(dòng)，說明其耐受高濃度礦添、膽堿、酸化劑等成分的抗逆性強(qiáng)，因而更適宜在預(yù)混料、濃縮料中使用。

5．結(jié)論

5．1 在相同的熱處理?xiàng)l件下，微丸型纖維素酶的耐熱性能同粉狀酶相比，前者要優(yōu)于后者。

5．2 在含酸化劑、膽堿及高含量微量元素的4%豬用預(yù)混料的貯存實(shí)驗(yàn)中，微丸型纖維素酶的損失過程不明顯，貯存8周后，其相對(duì)剩余酶活力仍在90%以上，貯存穩(wěn)定性高，適合于在預(yù)混料、濃縮料中使用。