50多年前研究者(Stokstad 等,1949)發現,飼喂金霉素(aureomycin ,chlortetracycline)對家禽生長具有促進作用,由此揭開了抗生素促生長作用的研究.人們最初將金霉素的生長促進作用歸功于金霉素中所含維生素B12的發酵作用(試驗雞日糧中沒有B12),但后來研究發現這種作用與維生素B12的營養作用無關(Stockstad 等1949).抗生素生長促進作用的商業重要性立即引起了人們的關注,隨后幾年所做的研究發現,抗生素的這種作用在豬和小牛身上表現更為明顯.1949年金霉素開始商業化生產，其后眾多別的抗生素產品面世并且以生長促進劑用于畜禽生產，以提高畜禽的生長效率（Jukes，1997）。不同種類的抗生素的結構不同，殺菌機制也有差別，包括破壞細菌細胞膜、調節代謝和抑制微生物細胞壁、蛋白質、DNA合成等。然而，所有飼抗生素對豬生長和飼養效率的改善作用都很相似，困此其生長促進機制明顯與其抗微生物作用模式無關（Lawrence, 1998）。盡管抗生素的生長促進作用不容置疑，然而它們提高動物生長的機制還比較模糊。抗生素的這種促進作用可能是因為它誘導腸道微生物群發生了變化，在以下綜述中我們歸納了與這種可能性有關的作用模式，并且對可供深入研究動物腸道微生物和動物生長效率之間相互作用的新型分子生物學技術進行了介紹。 1 抗生素對生長效率的提高作用 有充分的證據表明，飼喂抗生素提高動物生長效率具有經濟效益。Hays（1991）總結了抗生素對于主要的幾種動物的生長率和飼料利用率的改善作用。統計數據表明，抗生素在小豬上的應用效果要好于大大豬。數據也顯示，抗生素對增重的提高作用優于對飼料利用率的提高作用，表明飼喂抗生素后動物的采食量增加。然而有研究證明，在采食量恒定的情況下，抗生生素對增重和飼料效率也有提高作用（Jones和Tarrant，1982），證明抗生素對動物生長具有直接促進作用。 飼喂抗生素引起的生長率提高可能與其對蛋白質代謝的相應改善作用有關。Weldaon(1997)對幾個試驗的數據進行統計后證明，豬的泰樂菌素飼喂量從1×10-5提高到5×10-5后,氮表觀消化率提高3.0%,氮儲留量增加5.8%,氮排出量減少10%.研究表明,促生長抗生素有利于改善機體蛋白質代謝而與日糧中的蛋白質濃度無關(Roth和Krirchgessner,1993)。體外研究表明，生長豬添加抗生素后，肌肉細胞增殖加強，蛋白質更新率下降（Hathaway等，1990a,b）。Hathaway等（1996）研究證明,飼喂ASP-250(金霉素1×10-4,碘胺二甲基嘧啶1×10-4，青霉素5×10-5)后,仔豬血清中的類胰島素類生長因子(IGF-I)增多,并且提出,這種增多可能與抗生素的促進生長作用有關.許多研究都表明,外源性的IGF-I對動物具有生長促進作用(Nilsson等,1994)。 促生長抗生素的可能作用機制應該與其對動物生長、飼養效率、氮代謝和對幼齡動物的特殊作用相一致。下面就是對抗生素介導生長提高作用的這些具體細節進行的討論。 ２ 抗生素促進生長作用的可能機制 關于抗生素促生長作用機制的研究大部分都是在20世紀80年代中期以前的。在這方面做過比較完整綜述的有Francois（1962）、Visek(1978)和抗微生物飼料添加劑委員會（CAFA）(1997)的一項報道。這些綜述的共同點是都認為抗生素通過下面四個可能的作用機制促進了動物的生長：（１）抑制動物亞臨床感染；（２）減少具有生長抑制作用的微生物代謝物；（３）降低微生物對養分的利用；（４）使動物腸壁變薄，提高養分的吸收和利用（Visek，1998）。 大量證據表明，促生長抗生素對動物腸道微生物數量或活動具有調節作用（Visek,1978）。例如無菌動物飼喂抗生素無生長促進作用（Coates 等，1963）,而無菌動物從正常動物身上接種胃腸道細菌后則引起生長抑制(Coates,1980)；傳統的飼養于衛生條件比較差的環境中的動物飼喂抗生素后，生長性能提高比較明顯（Hays，1969;Roura等,1992）。抗生素促進生長最有可能的機制情節如下：動物腸道 中寄居有一種或幾種微生物，這些微生物雖然不一定都有致病性，但卻能抑制動物的生長；日糧中添加抗生素后，這些微生物受到代謝抑制或清除，它們的作用消失，動物生長加快（Coates,1980）。在雞身上所做的研究支持這一假說。研究表明，無菌雞腸道接種Ｇ+、兼性厭氧糞球蟲菌后引起了生長抑制（Fuller等，1979）；飼喂抗生素青霉素后，不利作用得到消除（Fuller，等，1983）。所有這些數據表明，飼喂抗生素與其說是促進了動物生長，還不如說是促進了動物的生長性能正常發揮。 本綜述通過討論豬小腸內原生微生物的生長抑制作用，強調了抗生素的生長允許概念。小腸內原生微生物生長抑制作用主要機理有：（１）與宿主競爭養分；（２）產生微生物代謝產物，使腸道黏膜代謝加快，從而降低了生長效率。飼喂抗生素可以提高養分利用率，降低胃腸道系統維持消耗，進而消除由微生物引起的生長抑制。我們也討論了使用新型分子生物技術鑒定豬胃腸道微生物菌群的必要性以及抗生素對局部腸道菌群的作用。 3 腸道細菌產生的生長抑制代謝物 3.1 酚/芳香族類復合物 酪氨酸和色氨酸在腸道中被細菌降解時會產生具有強烈毒性的酚類和芳香族類復合物，如苯酚、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、吲哚和3-甲基吲哚(糞臭素)等，這些物質都通過尿液排出(Deichmann和Witherup,1943)。無菌老鼠體內和尿液內沒有這些酚類復合物(Bakke和Midtvedt,1970)。一般認為，人類食物中的蛋白質增多會引起糞中的氨、揮發性含硫物質以及尿中的4-甲基苯酚增多(Geypens等，1997)。然而個體禁食時，盡管沒有任何的營養攝入，尿中苯酚和4-甲基苯酚的數量也沒有發生變化(Bures等，1990)。因此，尿中苯酚和4-甲基苯酚的排泄量不僅僅依賴于食物中的蛋白質含量，更有可能反映的是腸道細菌產生的內源性物質的代謝情況。斷奶仔豬尿中的4-甲基苯酚濃度與體增重之間呈負相關(r=-0.73)，表明微生物產生的4-甲基苯酚可能會抑制動物生長(Yokayama等，1982。飼喂ASP-250后，糞和尿中的酚類和芳香族類復合物(尤其是4-甲基苯酚)排泄量減少(Yokayama等，1982。老鼠飼喂含有10%酪氨酸的蔗糖日糧時，揮發性苯酚的排泄量增多會對體增重產生副作用，通過飼喂金霉素則可以消除這種不利作用(Bernhart和Zilliken，l958)。因此，降低細菌產生的酚類復合物可能是支持抗生素生長促進作用的潛在機制之一。 3.2 氨 氨是氨基酸被微生物脫氨基和尿素被脲酶水解時產生的有毒廢物(Visek，1981,1984)。人小腸內的細菌跟酶活動很普遍(Suzuki等，1979)。在豬身上沒有做過具體研究。普通動物結腸內的氨氣濃度是能夠引起細胞損害濃度的好幾倍(Visek，1978)，表明腸道尿素酶產生的氨氣對于氨氣的自然濃度具有顯著的生物學作用。有證據表明，微生物產生的尿素酶以及由此引起的高濃度氨氣對動物的生長有害。例如，無菌動物不發生尿素水解(Lvenson等，1959)，肛門氨氣濃度僅是普通對照組的25%(Warren和Newton,l959)。老鼠和雞尿素酶免疫后，與不免疫的對照組相比，體外脲酶活力下降，腸道氨氣濃度降低，生長加快(Dang和Visek,l960)。豬飼喂具有氨氣吸收作用的離子交換樹脂后，生長性能提高(Pond和Yen,1987;Veldmen和Vander Aar，1997)。Visek(1978)指出，降低微生物產生氨氣能力是飼用抗生素引起生長促進反應的主要機制。 3.3 膽汁酸的生物轉化 Feighner和Dashkevicz(1987，1988)指出，抗生素促生長的重要機制之一是抑制了腸道內微生物對膽汁酸的生物轉化。腸道微生物對膽汁酸的解離和去羥基化作用會削弱宿主動物對脂肪的吸收(DeSomer等，1963；Eyssen，1973)，產生抑制動物生長的有毒產物(Eyssen和Desomer，1963a)。膽汁酸在無菌動物腸道內不發生解離，證明腸道細菌在膽汁酸解離過程中起著重要作用(Madsen等，1976)。盡管別的一些細菌，如類菌體、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌等(Kawamoto等，1989；Stellwag和Hylemon,1976;Grill等，l995；Gopalsrivastava和Hylemon,1988)，具有膽汁鹽水解活力，但主要起水解作用的是寄居于小腸內的乳桿菌。去除老鼠腸道微生物菌群中的乳桿菌，理想的膽鹽水解活力下降86%;去除乳桿菌和腸球菌素，膽鹽水解活力下降98%以上(Tannock等，1989)。這些結果表明，乳桿菌是老鼠腸道內膽汁鹽水解酶總活力的主要提供者。對于雞而言，Eyssen和DeSomer(1963b)首先提出，腸道細菌引起的生長抑制可能與膽汁酸的轉化產物有關。有證據表明，雞腸道細菌解離膽汁酸所導致的生長抑制作用可以通過添加抗生素加以消除(Fuller等，1984)。進一步研究發現，飼喂抗生素的肉雞，小腸內膽磺酸水解酶活力水平與動物的生長率呈負相關(FeighnerDashkevicz，1987,1988)。豬飼喂抗生素后，腸道內膽酸濃度下降，日增重和飼料效率提高，與關于家禽的報道一致(Tracy和Jensen,1987)。還需要進行深入研究來驗證膽汁轉化對動物生長的抑制作用。 3.4 生長抑制性細菌代謝物 能夠產生以上生長抑制性細菌代謝物的腸道有機體比較多，有些已經鑒定出來，有些還有待確認。應用分子技術有望對腸道微生物的代謝活動有更加深入的了解。有必要指出的是，盡管不同種類的細菌可能會產生一種或幾種上述代謝物，小腸中占主要的革蘭氏兼性厭氧菌卻經常能產生所有的這三種毒素。這種現象有助于解釋為什么使用抗生素減少某些菌群數量或調整菌群代謝能夠促進動物生長。解釋特定細菌產生特定代謝產物的數據來源于培養基制作方法，因此應該謹慎對待。考慮到胃腸道細菌中只有10%～50%能夠在培養基上定植生長，目前培養的細菌是否在其自然過程中起主要作用值得懷疑，它們可能僅僅代表著自然數量的一小部分。結合系統發育和功能分子方法直接定性原位菌群，可以更好地解決這個問題。 令人奇怪的是，有些看來能抑制動物生長的有機體，即革蘭氏兼性厭氧菌，包括乳桿菌和腸道球菌，也常被用來作為微生態制劑(益生菌)中的有機物，用于提高畜禽健康和促進動物生長(Jonsson和Conway,l992)。益生菌和抗生素對畜禽的促生長作用機制不一樣(Jonsson和Conway,l992)。人和動物補充某些益生菌可以有效防止腸道致腹瀉病原菌致病(McCracjen和Gaskins,1998)。因此，益生菌可在某些病原菌存在的情況下促進生長，而同樣的有機物在干凈衛生的環境下通過上述代謝機制則會抑制動物生長。 4 腸道微生物與宿主在小腸中的競爭和在大腸中協同 我們目前關于宿主-細菌相互作用的知識，無一例外的來自于體外培養研究。這些方法有一定的缺陷，但是直到最近為止，它們仍是微生物學家的唯一工具。培養研究表明，小腸中的微生物活動與宿主存在著能量和氨基酸的競爭(Hedde和Lindsey，1986)。例如細菌利用葡萄糖生成乳酸，減少了宿主動物可以利用的能量(Saunders和Sillery,1982）。乳酸也能加速小腸蠕動，提高營養物質通過腸道的速率(Saunders和Sillery，1982)。由于小腸內細菌對葡萄糖的利用，豬日糧中的凈能損失可達6%(Vervaeke等，1979)。氨基酸被小腸細菌降解后，就不能被豬利用了，并且會產生氨、尸胺、4-甲基苯酚等有毒代謝物。盡管盲腸和結腸中的微生物活動與宿主存在協同作用(Hedde和Lindsay，1986)，估計豬總能中有5%～20%來自于腸道后段細菌的發酵作用(Friend等，1963);然而小腸是營養和能量的主要吸收部位，并且小腸中的細菌量要比大腸中小好幾個數量級(Stewart，1996)。因此我們認為，抗生素的生長促進作用源于小腸內菌群的大量減少以及由此引起的小腸上皮功能改變;而大腸微生物數量的變化對動物生長的影響甚微。大部分的促生長抗生素是針對革蘭氏陽性菌的，而小腸中占主要地位的細菌就是革蘭氏陽性菌(Stewart，1996)，這也可以作為這一假說的支持證據之一。有關胃腸道菌群空間分布的數據都是通過培養方法得來的，肯定存在偏差。我們認為，新興的分子技術將會對胃腸道菌群空間分布和分類成分影響動物生長的說法做出更加清楚的評價。 5 消化道細菌和腸道炎癥 腸道細菌在腸道免疫系統的發育過程中起著重要作用(Gaskins,1996)。消化道細菌的這種致免疫作用在無菌動物消化道免疫系統尚未成熟時最易觀察到，這時腸道淋巴組織不健全，淋巴細胞(B和T-細胞)很少，抗體濃度較低(Wostmann，1996)。無菌動物接種整套腸道細菌后，這些免疫參數進入正常狀態(Carter和Pollard，1971)。研究無菌動物接種個別細菌或已知細菌組時發現，不同種類細菌的致免疫作用不同，有的很強，有的中等，有的很弱甚至沒有致免疫作用(McCracjen和Gaskins,l999)。很明顯，細菌刺激腸道免疫系統發育對于動物的保護性免疫非常重要。然而，促生長抗生素發揮作用的潛在機制之一是減少寄居在小腸內的致免疫性細菌。通過限制小腸細菌生長，促生長抗生素可以降低普通動物胃腸道本身的低水平感染，從而降低與此有關的能量消耗。因此飼養環境將會影響到動物局部感染消耗和免疫完整必要性之間是否收支相抵。Stahly等(1995)研究了泰樂菌素對于常規斷奶仔豬和藥物治療斷奶仔豬的生長速率、飼養效率和胴體組成的影響。他們確定，飼喂泰樂菌素能夠提高增重、增加體蛋白和降低體脂肪，但常規斷奶組反應幅度最大，或許是因為受致免疫原刺激較大的原因。Roura等(1992)研究了肉雞免疫活力狀態與抗生素生長允許能力之間的關系。他們提供的數據與下面的假設一致，即通過飼喂抗生素預防致免疫原應激和由細胞因子引起的代謝變化，可以使動物的生長性能得到正常發揮。 6 細茵對消化道代謝和維持能量需要的改變作用 一般消化道細菌的存在會使消化道壁變厚，腸道重量增加、吸收能力下降，并且使黏膜細胞代謝更新率加快(Commission on Antimicrobial Feed Additives, 1997)。這些作用的原因不明，但可能與宿主對細菌性抗原以及上面所提到的代謝產物的反應有關。在無菌動物身上做的研究表明，飼喂抗生素可以降低或者防止這些不利作用。無菌動物和一般動物的最明顯區別就是，無菌動物小腸壁較薄、聯系組織和淋巴組分少(Coates,1980)。在顯微鏡下觀察無菌動物腸道可發現，其絨毛結構更加規則、細長，基底層較薄。并且無菌動物腸道上皮細胞的代謝更新率較慢，可能更有利于減少營養利用中的基本能量消耗，提高能量利用率。這些觀察與Reeds等(1993)的觀點一致，他們認為，在快速生長的幼鈴動物中，胃腸道和骨骼的肌肉組織在營養沉積過程中存在競爭作用。 SPF豬的維持能量低于常規飼養的同窩豬(Verstegen等，1981;)。研究用的小豬通過子宮切開術得到。每窩小豬一半運到商業養豬場中由代育豬代養，一半保持在無菌環境中，以期引起消化道菌群的早期不同。10～12周時，各組動物都轉運到單獨的呼吸室中，飼養至大約105kg。試驗豬彼此隔離，環境高度衛生，進風用紫外線處理，飼料進行輻射。體重為105kg時，SPF豬的消化道空重(2872：3003g)、大腸腸系膜淋巴結重量(51：84)都比對照組低。SPF豬的維持能量需要少，與消化道正常微生物影響維持能量需要的假設相一致，并且即使在高度衛生的環境中，這種作用也可能延續到生長育肥階段。 7 腸道微生態研究新技術 直到最近為止，消化道微生態研究還是容易受到培養基計數和定性內在局限性的制約。DNA和RNA技術的發展可以不用培養方法進行菌群鑒定和計數(Mackie等，1998)，因此可以對豬胃腸道微生態系統和促生長抗生素對于胃腸道菌群的改變作用進行重新評估。例如利用既包含高度固定區域也有一定可變區域的16SrRNA分子，不但可以定性混合菌群中的細菌種屬，也可以確立不同種屬細菌之間系統發育的關系。McCracken等(研究但未正式發表)用16SrRNA研究分析了微生物種群與抗生素對腸道細菌的作用。選取17周齡的老鼠，飼喂試驗標準日糧，飲水中無抗生素或加有25×10A-5的頭孢噻吩。抗生素處理后第7d采集糞樣，從糞樣中去除DNA，利用編碼16SrRNA的固定16SDNA分子的引物進行PCR序列分析。由于PCR引物與細菌中的固定序列相對應，所以PCR產物大致代表了糞樣中的所有細菌種類。然而細菌種屬間的插入DNA序列變化較大，不同的序列可以用變性劑梯度凝膠電泳法(DGGE)(Muyzer等，1996)通過G+C核苷酸分析加以分離，這種方法中聚丙烯酰胺凝膠中使用的DNA變性劑尿素和甲酰胺的濃度是線性增加的。最終結果證明，這種方法有助于觀察抗生素誘導腸道微生物菌群發生的變化。可以用影象分析系統對個體頻帶強度進行相關分析。最后可以將個體頻帶從凝膠中分離、克隆、延長，對它們的出現、消失或使用抗生素后的強度變化進行鑒定。傳統上利用的特異性16SrRNA探針膜雜交方法使細菌個體種類或種屬的鑒定成為可能。 8 結 語 抗生素有益作用的準確機制尚不清楚。有人提出消化道近端的促生長抗生素通過調整消化道的小微生物群落提高了動物腸道以及動物整體的生長效率。過去的40多年中，有關豬生長的研究主要是直接通過改變肌肉和脂肪代謝來影響生長、飼料效率和胴體組成。為正確評價正常消化道菌群在動物生長中的作用，有必要正確理解消化道生理學、微生物學和免疫學之間的相互關系，以及它們對于豬生長的作用。鑒于此，現在可用的分子技術就更加讓人興奮了，因為它可以使我們更好的理解使用抗生素對于消化道微生物分布的影響。這些進展促進了新興技術、管理系統和營養調控的發展，這些發展成果應用到動物生產中則有助于優化動物消化道健康和促進動物生長。