益生素是以活菌成分為主的飼料添加劑。它的主要機理在于給動物直接飼喂微生物的活菌制劑，以平衡動物的腸道菌群，加強腸道微生物的屏障功能，減少有害菌群的毒害作用，提高機體免疫力，同時分泌酶等一些有益的代謝產(chǎn)物，提高飼料的利用率，從而使動物健康快速生長[1，2]。作為益生菌的一種，枯草芽孢桿菌在動物生產(chǎn)中的研究與應用一直都是畜牧業(yè)科研和生產(chǎn)人員關(guān)注的焦點。枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶以及維生素等有益代謝產(chǎn)物。我們在益生素的研制過程中分離到一枯草芽孢桿菌N株，并對其發(fā)酵代謝產(chǎn)物進行了測定，為揭示芽孢桿菌促進生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率的機理提供了理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 菌種為枯草芽孢桿菌N株：由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院分離并保存并經(jīng)中科院微生物所鑒定。 液體種子培養(yǎng)基:牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000 mL、pH7.0,0.1MPa滅菌30min。產(chǎn)酶培養(yǎng)基:玉米粉5%、麩皮3%、豆粕2.5%、硫酸銨0.5%、氯化鈣0.05% 、pH7.0,0.1MPa滅菌30min。 主要儀器：氣相色譜儀GC-9A、RF-5301PC熒光光度計（日本島津）、UV-2000型紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、高速離心機、1/萬分析天平、蒸氣消毒器、控溫搖床。 1.2 方法： 1.2.1種子液制備 每250mL三角瓶裝50mL液體種子培養(yǎng)基，在0.1MPa滅菌30min，冷卻后從斜面接一環(huán)菌苔至種子培養(yǎng)基，置37℃控溫搖床（220rpm）培養(yǎng)，至芽孢率達90%以上時停止培養(yǎng)，約需24小時。 1.2.2 接種與培養(yǎng) 取1mL種子液，接入盛有100mL無菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500mL三角瓶中（接種量為1%，v/v）。置搖床中37℃振蕩培養(yǎng)至芽孢率達95%以上時停止發(fā)酵。 1.2.3 粗酶液的提取 將發(fā)酵液于3500rpm下離心20min，取上清液為粗酶液。 1.2.4 淀粉酶活力的測定[3]：采用細菌α-淀粉酶活力的測定方法。淀粉酶活力單位(U)：1mL酶液在60℃，pH6.0的條件下，每分鐘液化1ug可溶性淀粉的酶量為一個酶活力單位。 1.2.5 蛋白酶活力的測定[3]：采用福林-酚法測定。蛋白酶活力單位(U)：1mL酶液在40℃，pH7.5（堿性蛋白酶為pH11.0）的條件下，每分鐘水解酪蛋白為1ug酪氨酸的酶量為一個酶活力單位。 1.2.6 脂肪酶活力的測定[3]：脂肪酶在一定條件下能將甘油三酯水解釋放出脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯及甘油，脂肪酸用標準堿液滴定，用滴定值表示酶活力。脂肪酶活力單位(U)：1mL酶液在40℃，pH7.5的條件下，每分鐘產(chǎn)生1ug脂肪酸的酶量為一個酶活力單位。 1.2.7發(fā)酵液中揮發(fā)性脂肪酸的測定：將芽孢桿菌發(fā)酵液以3500rpm離心20min，取上清夜用氣相色譜儀進行乙酸、丙酸和丁酸的含量測定。采用FFAP柱，氫焰檢測器，柱溫150℃，汽化室溫為200℃，量程為10-9，衰減度為16；N2做載氣，流速為40ml/min，H2流速為35ml/min，空氣流速為250ml/min。將所得到的峰面積與標準樣在相同條件下得到的峰面積比較，求得樣品中乙酸、丙酸和丁酸的含量。 1.3.5 發(fā)酵液中維生素C的測定：將芽孢桿菌發(fā)酵液以8000rpm離心10min，取上清夜，用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定發(fā)酵液中的維生素C含量。 1.3.6 發(fā)酵液中維生素B1的測定：將芽孢桿菌發(fā)酵液以8000rpm離心10min，取上清夜，用熒光法在激發(fā)波長332nm、發(fā)射波長392nm處測定熒光強度，其熒光強度與發(fā)酵液中的維生素B1含量成正比。 1.3.7 發(fā)酵液中維生素B2的測定：將芽孢桿菌發(fā)酵液以8000rpm離心10min，取上清夜，用分光光度計法在444nm處測定發(fā)酵液中的維生素B2含量。 1.3.8 發(fā)酵液中維生素B6的測定：將芽孢桿菌發(fā)酵液以8000rpm離心10min，取上清夜，用熒光法在激發(fā)波長326nm、發(fā)射波長395nm處測定熒光強度，其熒光強度與發(fā)酵液中的維生素B6含量成正比。 2 結(jié)果 2.1 各種酶活力的測定結(jié)果：該芽孢桿菌發(fā)酵液中淀粉酶活力為576U ；中性蛋白酶活力為220U ，堿性蛋白酶活力為20.6 U，脂肪酶活力為7.1 U 。另外還有少量的纖維素酶和植酸酶。 2.2 揮發(fā)性脂肪酸的測定結(jié)果：該芽孢桿菌發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量分別為0.225g/L、2.59g/L、3.49g/L。 2.3 各種維生素的測定結(jié)果：該芽孢桿菌發(fā)酵液中VC的含量為0.878mg/L，VB1的含量為21.33 mg/L，VB2的含量為9.31 mg/L，VB6的含量為0.204 mg/L。 3 討論 3.1 枯草芽孢桿菌N株在其生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和少量脂肪酶、纖維素酶、植酸酶等酶類。動物飼料中添加該芽孢桿菌制劑，在其腸道中將產(chǎn)生以上消化酶，促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率。另據(jù)報道芽孢桿菌在動物腸道中還可產(chǎn)生氨基化氧化酶及分解硫化氫的酶類，可將吲哚類氧化成無毒、無害的物質(zhì)，從而降低動物舍內(nèi)氨氣、硫化氫、臭氣的有害氣體的濃度，減少環(huán)境污染。 3.2 枯草芽孢桿菌N株在其生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，這些物質(zhì)能夠降低動物腸道pH值，可有效抑制有害菌的生長，為乳酸菌的生長創(chuàng)造了酸性條件。另外丙酸還能夠參入三羧循環(huán)，為動物提供能量。 3.3 枯草芽孢桿菌N株在其生長繁殖過程中能夠自身合成VC、VB1、VB2、VB6 ，為動物提供營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進動物生長和提高其生產(chǎn)性能。 3.4本研究證明了芽孢桿菌進入動物腸道，除了發(fā)揮益生素預防疾病的功能外，還能夠產(chǎn)生各種消化酶，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率，為動物提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進生長。為今后更加合理的使用芽孢桿菌制劑提供了理論依據(jù)。