1 抗菌肽與LfcinB的發現

　　抗菌肽是宿主防御系統產生的一類對抗外界病原體感染的肽類物質，是宿主免疫防御系統的重要組成部分（Papagianni，2003）。抗菌肽抗菌廣譜，對病毒、寄生蟲、癌細胞均有抑制作用。天然的抗菌肽通常是由十幾個至幾十個氨基酸殘基組成的小分子多肽，多小于10 kDa，含多個帶正電荷的氨基酸如賴氨酸（Lys）或精氨酸（Arg），多數抗菌肽pI大于7，表現出強陽離子性，N端親水，C端疏水具有雙親性，水溶性和熱穩定性好，對高離子強度和pH值均具有較強的抗性。此外部分抗菌肽具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力，例如牛乳鐵蛋白肽Bovine Lactoferricin。抗菌肽由基因編碼、核糖體合成（Reddy等，2004），或由大分子功能蛋白降解形成。

　　Boman小組首次通過對滯育的天蠶Hyalophora cecropia蛹注入Escherichia coli，誘導蠶蛹血淋巴分離出兩種低分子量的具有極強抗菌活性的肽類物質（Hultmark等，1980）。后霍夫曼等證實了這些肽的存在，先用細菌培養液注射昆蟲，12h～24h后昆蟲產生了大量的肽類抗菌物。Steiner等在Nature上公布了該類肽的一級結構并正式命名為天蠶素 Cecropins（Steiner等，1981）。迄今，已從動物不同組織中分離并鑒定出100多種抗菌肽。

　　前面提到的乳鐵蛋白活性多肽（Lactoferricin，簡寫為Lfcin）是15年前發現的一種新型抗菌肽。Lfcin具有多種生理活性，是乳鐵蛋白活性中心，具有抑菌殺菌、抗癌、調節免疫、抗病毒等多種乳鐵蛋白所具有的生物學功能。Abe等(1991)在研究酸性條件下乳鐵蛋白（LF）的熱穩定性時發現，經熱處理后LF發生明顯的降解，但抑菌活性卻強于未經熱處理的LF，于是推測在LF加熱降解后產生了抑菌活性強于LF的多肽。Tomita等（1991）研究了牛LF經蛋白酶降解后產生的多肽的抗菌作用，結果表明，豬胰蛋白酶水解所得小分子多肽抗菌活性顯著提高，具有廣譜抗菌活性，能抑制多種 G+和G-細菌生長，其中包括對LF具有抗性的菌株，且迄今未發現病原菌對其耐藥性的報道。Bellamy等（1992a）在牛LF的胃蛋白酶解產物中分離得到一段N端多肽，其抗菌活性比LF強400多倍，將其命名為Lactoferricin（簡寫為Lfcin），此后，相繼在人、小鼠、山羊和豬（Strom等，2002）等動物LF中發現Lfcin同源物。其中，由于牛Lfcin（LfcinB）抗菌活性最強而成為研究熱點。LfcinB來源于牛乳鐵蛋白的17-41位AA，由25個AA殘基組成，AA順序為Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met- Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe（Bellamy等， 1992b）。作者小組近幾年對Lfcin的作用機制（馮興軍等，2004）、融合表達研究（Feng等，2005；田子罡，2006）以及包含有此新型抗菌肽在內的肽類抗生素的轉基因表達策略探討（馮興軍等，2006）分別有專門報道或論述。

　　2 LfcinB生物學功能

　　2.1 抑菌與殺菌

　　Lfcin抗菌廣譜，包括許多G+和G-病原菌，例如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌等，與牛乳鐵蛋白相比， LfcinB的抗菌活性提高了400多倍（Bellamy等，1992b）。除對原核細胞作用外，LfcinB對真核微生物如霉菌、酵母也具有抑制作用。實驗表明，LfcinB及其衍生物能夠抑制培養基中毛癬菌（Trichophyton）、白色念球菌(Candida albicans) 等真菌病原體的繁殖，抑制其菌絲生長，口服LfcinB能夠改善動物感染毛癬菌病狀，縮短治愈時間（Wakabayashi等，1999b；2000）。 LfcinB對包括真菌在內的微生物均有抑制作用，除個別G+外，生長在1%蛋白胨培養基或Sabouraud葡萄糖培養基的真菌、G+和G-在較低 LfcinB濃度下不能生長，MIC為10μg/ml左右（唐傳核等，2000）。Bellamy等（1992b）研究了28種菌株對LfcinB的敏感性，所選待測菌株包括G+和G-、桿菌和球菌、專性需氧菌、兼性厭氧菌和專性厭氧菌，測定了在蛋白胨基礎培養基(細菌蛋白胨10 g/l)和YPG培養基(細菌蛋白胨10 g/L；酵母浸膏0.5 g/l；葡萄糖10 g/l)上LfcinB的有效抑菌質量濃度，結果表明，隨菌株和培養基變化，有效抑菌質量濃度范圍為0.6～150 μg/mL，并發現G+對LfcinB比G-更為敏感。

　　Lfcin抗菌活性受多種因素影響。Lfcin屬陽離子型抗菌肽，靠靜電作用與微生物質膜結合，在這一過程中離子性反應起著至關重要的作用。因此，影響 Lfcin與質膜間離子性反應的因素就可能影響Lfcin的抗菌活性，例如提高溶液中Ca2+、Mg2+等陽離子的離子強度、增加Tris、Hepes、 PIPES緩沖液濃度，都會顯著降低Lfcin抗菌效果。此外，培養基、菌株不同對Lfcin的抗菌活性也有一定影響（Bellamy等，1992b；許時嬰等，2001）。

　　2.2 抗寄生蟲

　　Turchany等（1995）研究發現，LfcinB和LfcinH能夠抑制賈第鞭毛蟲的生長，殺死培養基中的賈第鞭毛蟲。與LF相比，雖然 LfcinB和LfcinH不能與Fe 3+結合，但Fe3+能夠減弱LfcinB和LfcinH對賈第鞭毛蟲的抑制作用；Turchany等（1997）通過進一步研究證實，Fe 3+能夠抑制LF或Lfcin與賈第鞭毛蟲的結合，表明Lfcin對賈第鞭毛蟲的抑制作用不僅與賈第鞭毛蟲的鐵利用有關。

　　Tanaka等（1995）研究發現LfcinB對體外環境下的鼠弓形體（Toxoplasm gondii）具抑制作用。Omata等（2001）進一步實驗發現，小鼠胚胎細胞與經LfcinB處理后弓形體的孢子共同培養，細胞存活率顯著高于對照組；此外，將LfcinB處理的兔肝艾美爾球菌（Eimeria stiedai）的合子感染體外培養的兔肝臟細胞，也得到了相同的結果。實驗表明，LfcinB可有效減弱弓形體、兔肝艾美爾球菌等病原蟲對宿主細胞的感染力。對于感染弓形體的小鼠，每天飼喂5.0 mg或皮下注射0.1 mg LfcinB實驗組小鼠無一死亡，而對照組死亡率達80%，同時，兩處理組小鼠腦組織中感染的寄生蟲量也明顯低于對照組，結果表明LfcinB能有效抵制弓形體對小鼠的侵染。

　　2.3 抗病毒

　　LfcinB可降低細胞巨化病毒和HIV（Berkhout等，2002）、皰疹1型和2型病毒（Jenssen等，2004）、腺病毒（Di Biase等，2003）、輪狀病毒（Superti等，2003）、脊髓灰質炎病毒和貓嵌杯樣病毒（McCann等，2003）等對宿主細胞的感染力，抑制病毒顆粒復制，如通過結合細胞膜硫酸乙酰肝素（HS）封閉皰疹病毒的結合受體，抑制皰疹病毒對細胞的感染，通過封閉CXCR4或CCR5受體抑制 HIV對宿主細胞的吸附，最新研究認為Lfcin所帶正電荷、疏水基團和環狀結構等因素都與其抗病毒“吸附-封閉”機制（McCann等，2003； Anderson等，2003）有關。

　　2.4 抗癌

　　體外研究表明，LfcinB對轉化細胞具有細胞毒作用，能抑制THP-1人單核白血病細胞（Yoo等，1997）、人白血病細胞HL-60（Roy等， 2002）增殖及生長發育，啟動腫瘤細胞凋亡程序，增加細胞內活性氧水平，提高Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶活性，導致細胞形態異常、染色體凝集、 DNA片段化、凋亡小體等細胞凋亡特征的出現，最終殺死癌細胞。此外，研究發現，小鼠皮下注射LfcinB能夠抑制黑色素瘤細胞及淋巴瘤細胞的轉移（Yoo等，1998）。

　　2.5 調節免疫與消炎

　　蛋白質或多肽在初生哺乳動物消化道內可以被完整吸收并轉運；在正常動物或人消化道中，酶解釋放的游離氨基酸經鈉泵或非鈉泵吸收，二肽或三肽由特異性轉運載體吸收，3肽以上的多肽很難被消化道以非特異性吸收形式進入血液。因此，口服Lfcin（25AA）能調節動物機體免疫水平分子、輔助殺死體內致病細菌、原蟲或病毒（Isamida等，1998；Omata等，2001；Wakabayashi等，2000）等作用的實現方式就成為研究熱點。 Davidson等（1988）報道，在小腸刷狀緣細胞膜存在LF特異性結合受體，Lfcin在LF與受體結合過程中起重要作用，人們推測LF和 Lfcin可能會以受體介導形式被小腸粘膜特異性吸收，但至今未被實證。腸道淋巴細胞存在LF特異性結合受體；Lfcin能與人多形核白細胞作用，促進釋放對中性粒細胞具激活作用的干擾素-8（Shinoda等，1996）。由此，LfcinB作用模式依然停留在通過與消化道免疫系統作用，增強細胞免疫反應，間接提高宿主抵抗力的觀點上。

　　2.6 抗氧化

　　機體內氧自由基過剩，會造成構成細胞組織的各種物質，如脂質、糖類、蛋白質、核酸等所有的大分子物質發生各種氧化反應，引起變性、交連、斷裂等氧化傷害，近而導致細胞結構和功能的破壞，以及機體組織損傷和器官病變。因此，過剩的氧自由基被認為是衰老或疾病的征兆。在通常情況下，鐵等金屬離子能夠起到催化劑的作用，加速氧自由基的產生，乳鐵蛋白能夠鰲合鐵離子，抑制鐵引起的脂質氧化作用。與乳鐵蛋白相比，雖然LfcinB不能結合鐵離子，但體外研究表明， LfcinB同樣能抑制鐵離子的催化作用，阻斷脂質體氧化，減少自由基生成（Wakabayashi等，1999）。

　　3 Lfcin的制備

　　乳鐵蛋白分布廣泛，在動物乳特別是牛初乳和乳清中含量豐富，是目前商用LF的主要來源，可以通過色譜法、超濾法、鹽析、酸沉淀等方法制得。LfcinB可由LFB水解制得。美國專利（Tomita等，1994）利用牛LF為原料，經胃蛋白酶在酸性條件下水解后，離心，利用陽離子或疏水性親和色譜技術分離、洗脫、脫鹽、冷凍干燥制得純度達99%以上的LfcinB，產率較其它方法有很大提高，每1000 ml親和介質可獲得3～5 g LfcinB，是生產藥用Lfcin的有前途方法之一，但該方法回收率低，工藝較復雜，成本較高。

　　多肽化學合成技術日趨完善，利用多肽自動合成儀可以準確合成一定氨基酸順序的多肽，該技術用于少量合成Lfcin及其多種衍生物，是研究Lfcin活性與結構的關系、明確Lfcin作用機制、調節Lfcin的功能以及開發具有特定功能與性質的Lfcin衍生物的重要方法與手段。但該方法合成的Lfcin價格十分昂貴，僅使用于實驗室的小量制備。

　　利用基因工程生產Lfcin具有廣闊的應用前景，Lfcin屬于多肽，利用DNA合成儀直接合成編碼Lfcin的DNA，并構建表達載體，在乳腺反應器或微生物中高效表達Lfcin具可行性。但由于Lfcin抗菌廣譜，宿主表達的Lfcin可能會對微生物宿主本身產生反饋性抑制作用，達不到高效表達的理想結果；因此構建Lfcin的表達體系的同時，要考慮篩選對Lfcin具有一定抗性的宿主微生物，這雖然增加了基因工程生產Lfcin的難度，但因生物技術的迅速發展，仍不失為實現Lfcin產業化最有希望的途徑之一，在此方面我們實驗室做了一些有意義探索（馮興軍，2005；Feng等，2006；田子罡，2006），并首次在國際上報道了優化Lfcin基因在大腸桿菌融合表達的結果（Feng等，2006）。

　　4 Lfcin作為飼料添加劑的應用前景

　　LfcinB等抗菌肽由于自身的優良特性顯示出在食品儲存、飼料安全和醫藥產業中廣泛的應用前景。Lfcin不含有稀有氨基酸和外源化學成分，是一種健康安全產品。Lfcin在動物消化道中具有良好穩定性，同時具有免疫原性小、水溶性好、廣譜殺菌甚至能夠殺真菌、原蟲等優點，能耐受胃腸道中蛋白酶及肽酶的降解。Kuwata等（1998；2001）研究指出，LF在消化道中經酶解后其活性片段沒有受到破壞。Lfcin具有良好的熱穩定性，特別是在酸性條件下，加熱甚至是高溫高壓處理對其抗菌活性沒有影響（Tomita等，1991），因此Lfcin不僅能夠耐受飼料加工過程中高溫高壓的劇烈條件，并且可以在飼料保存過程中持續發揮其功能，保持飼料品質，延長貯存期限。Lfcin具有廣譜抗菌抑菌活性，抑制或殺死發生病變的真核細胞，且對較大的離子強度和較低或較高pH有較強的抗性，并與常規抗生素通過阻斷生物大分子合成的作用機制完全不同，病原菌不易對其產生耐藥性，由此顯示了它獨特的研究和應用價值。如利用Lfcin抑菌活性，抑制產品在加工及銷售中滋生的有害細菌，延長產品貨架期，同時可用于飼料中起到天然防霉防腐劑的作用，用于防止造成飼料污染的致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等，以及引起飼料霉變的多種霉菌。此外，Lfcin具有多種生物學功能，在醫藥領域作為一種免疫增強劑已開始應用于提高機體非特異性免疫功能。由于其價格昂貴、抗菌活性還不夠理想及來源問題等不利因素，限制了其在畜牧生產中的應用，因此可以由這些角度入手，著力解決提高Lfcin生產效率，降低生產成本。此外，Lfcin在動物營養中的研究還很少。因此，應加大加快這方面的研究工作，使Lfcin盡快為綠色畜牧業發展發揮其應有的作用。