| 本研究的目的在于對小麥中的蛋白質進行甲醛保護，使它們在瘤胃中免遭微生物過度降解，以便在胃蛋白酶的作用下釋放出阿片活性肽，從而進一步調節反芻動物的消化代謝和內分泌，為提高小麥的飼料利用率提供實驗依據。 1 材料與方法 1.1 試驗材料3 頭裝有永久性瘤胃和十二指腸瘺管的成年、空懷、健康的母湖羊。試驗按自身對照設計，分I 期（對照期）和II 期（試驗期）。每期為時8 d，各期之前都有7 d 的適應期。2 期均為自由采食干稻草并定量添加精飼料。精飼料配方為：豆餅100 g/kg（10 %），小麥885 g/kg（88.5 %），尿素5 g/kg（0.5 %），磷酸氫鈣10 g/kg（1 %）；試驗期精飼料中的小麥550 g/kg （55 %）經甲醛處理（0.6g 甲醛/kg 小麥）（Yao 等，1992）。 1.2 試驗方法 1.2.1 樣品采集和處理。于每期試驗的第4、6、8天采集瘤胃液和十二指腸食糜，時間為4∶00，8∶00，12∶00，16∶00，20∶00，24∶00。采后立即- 20 ℃凍存。于試驗期的第8 天，由臨時性靜脈血管插管采集血樣，時間為12∶30 ～15∶30 每15 min 采樣1次，血樣經抗凝預處理，離心獲得血漿。 1.2.2 測定指標及方法。揮發性脂肪酸（VFA）用氣相色譜法測定。十二指腸食糜流量用EDTA- Cr標記法測定（鉻離子以原子光譜法測定）。氨氮以靛藍染色法測定。中性洗滌纖維（ADF）用VanSoest 的酸性洗滌法測定。血漿胰島素用放射免疫法測定。日糧和食糜總氮用凱氏定氮法測定。將每頭羊每天5 個時間點的十二指腸食糜樣品等量混合成一個樣品，12000 r/min 離心5 min，取上清液，并利用NG108- 15 細胞測定上清液中的阿片樣物質活性。其原理為：神經膠質瘤細胞NG108-15 內的腺苷酸環化酶活性受細胞表面的阿片受體調節，阿片樣物質可抑制該酶活性，而納洛酮（一種阿片受體拮抗劑）可消除阿片樣物質對該酶 活性的抑制。從而可以通過有或無納洛酮，NG108- 15 細胞內cAMP 濃度的差別，即對腺苷酸環化酶的抑制程度來確定溶液中的阿片樣物質活性（Brantl 等，1979；Sharma 等，1975）。具體操作步驟為：將1640 細胞培養基、十二指腸食糜上清液、無菌水（或1mmol/L 納洛酮）按1∶0.8∶0.2 的比例進行混勻。將貼壁良好的NG108- 15 培養基傾去，加入前述混合液共同孵育15 min 后，加入三氯醋酸中止反應。然后吹散細胞，4000 r/min 離心收集細胞，清洗后破碎細胞，12000 r/min 離心，取上清液，分別取部分上清液進行蛋白質濃度及cAMP 濃度測定（Zhang 等，1999）。cAMP 的量以放射免疫法進行測定，以每毫克細胞蛋白質所對應的cAMP 量來表示細胞內cAMP 的含量，單位為：pmol/mg。cAMP 放射免疫法測定試劑盒由上海中醫藥大學同位素室提供，胰島素放射免疫法測定試劑盒由上海生物制品廠提供。本試驗中阿片樣物質總生物活性以腺苷酸環化酶的抑制程度來表示，其計算方法為：腺苷酸環化酶的抑制率（%）=（有納洛酮時－無納洛酮時）/有納洛酮時×100。 1.3 數據處理所有數據均以X±SE 表示。用t檢驗法進行差異顯著性分析。 2 結果與分析 2.1 采食量的變化由表1 可見，試驗期湖羊的粗飼料采食量比對照期增加7.99 %（P < 0.05）。 其中ADF 的攝入量上升7.02 %（P < 0.05），總氮攝入量上升2.71 %（P < 0.05）。 2.2 瘤胃消化代謝的變化由表2 可見，試驗期瘤胃液總揮發性脂肪酸（TVFA）水平與對照期相比無顯著變化、瘤胃液NH3- N 水平略有上升。 2.3 十二指腸區消化代謝的變化見表3。與對照期相比，試驗期湖羊十二指腸食糜日流量平均下降5.16 %，但差異不顯著；總氮日流量上升18.86 %（P < 0.01）、NH3- N 日流量略有上升、非氨氮（NAN）日流量上升20.16 %（P < 0.01）、過瘤胃蛋白（BPN）上升38.70 %（P < 0.01）；ADF 復胃消化率平均提高8.79 %（P < 0.01）。此結果表明，進入十二指腸的總氮量上升，尤其是過瘤胃蛋白上升極顯著；ADF 復胃消化率極顯著提高。2.4 十二指腸食糜中阿片樣物質總活性的變化見表4。當在NG108- 15 細胞培養基中加入十二指腸食糜上清液時，試驗期的NG108- 15 細胞內cAMP 水平比對照期低58.87 %（P < 0.01）。而在NG108- 15 細胞的培養基中同時加入十二指腸上清液和納洛酮溶液時，試驗期的細胞內cAMP 水平與對照期相比無顯著差異。由表4 可見，與對照期相比，試驗期十二指腸食糜上清液對NG108-15 細胞內腺苷酸環化酶的抑制增強了72.30 %（P< 0.01）。 2.5 試驗期湖羊血漿胰島素水平的變化試驗期湖羊血漿胰島素水平上升104.91 %（P <0.05），對照期16.30 ±6.99 μU/mL；試驗期33.40±15.26 μU/mL。 3 討論 以前對反芻動物日糧中蛋白質進行保護的研究，大多是針對增加過瘤胃蛋白含量。本試驗發現，日糧中的小麥經保護性處理可提高湖羊的粗飼料采食量、提高ADF 的復胃消化率，增加過瘤胃蛋白量，提高湖羊的血漿胰島素的同時，湖羊十二指腸食糜中阿片樣物質的總活性也增強。研究表明，谷蛋白等食物蛋白不僅在體外經胃蛋白酶g/d水解，能產生具有阿片活性的肽類，在體內消化時也可產生阿片活性物質（Schusdziarra 等，1981）。食物源阿片活性肽不僅能夠對胃腸道消化液的分泌起調節作用（Trompette 等，2003），而且會影響動物體的內分泌調節（Schusdziarra 等，1981）。這與本試驗結果一致。利用甲醛保護反芻動物日糧中的小麥蛋白質，不僅過瘤胃的小麥谷蛋白增加，這些小麥谷蛋白在胃蛋白酶的作用下可能會釋放出阿片活性肽，從而使十二指腸食糜中阿片樣物質的總活性增強，進而改善湖羊的復胃消化代謝和內分泌機能。由于小麥中的蛋白質在消化酶作用下，會產生多種阿片活性肽（Fukudome 等，1997；Fukudome 和Yoshikawa，1993、1992），而且反芻動物消化道中也會產生內源性阿片活性肽，因此我們僅測定了皺胃食糜中阿片樣物質總的生物活性。關于小麥中的蛋白質在湖羊消化道中形成阿片活性肽的種類與數量，以及形成的阿片活性肽對反芻動物的消化和內分泌的調節機理有待進一步的研究。目前，隨著農業科技的不斷發展，小麥的產量不斷提高，國內有一定份額的小麥已成為或必將成為反芻家畜飼料。由于傳統的飼料加工方法，使這一部分小麥的飼料報酬過低，從而影響了相關的種植業和養殖業的積極性，本研究的結果對解決上述問題提供了新思路。
表2 瘤胃消化代謝的變化
表3 十二指腸氮流量和復胃ADF 消化率的變化
表4 NG108- 15 細胞內cAMP 含量的變化（n=9）
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甲醛處理日糧小麥蛋白對湖羊消化代謝及內分泌的影響 |
| 作者： | 來源： | 日期：2006-11-16 |
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