1材料與方法
ll菌株和培養(yǎng)基
l l 1 XYl905本實驗室從南寧紙廠土壤中篩選．
1．1 2種子培養(yǎng)基(g/l) (NH4)2SO40.5，K2HPO4 1.0
MgSO4-7H2O O．3，CaCl2·2H2O 0．2，K2SO4 O．1，NaCl O 2，自 制玉米芯半纖維素15．DH7。
1．1 3產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g／1)將種子培養(yǎng)基中的半纖維素改為稻草粉28和麩皮12．DH7。
1．2試劑
1-2．1 D一木糖(sigma)溶液10umol／ml 0．15g溶于檸 檬酸緩沖液中定容至100 m1．
1．2．2底物l％1g燕麥木聚糖(slgma)加入檸檬酸 緩沖液中磁力攪拌過夜．定容至100 tnl．
1-2 3 CtNS試劑 取酒石酸鉀鈉182g溶于500ml水 中，加熱(不超過60℃)，在熱溶液中依次加人3．5一二 硝基水楊酸6 3g、NaOH 21g、苯酚5g、亞硫酸鈉5g攪 拌使它們?nèi)芙猓鋮s后定容至1 000 m1．貯于棕色瓶． 兩周后方可使用。
1 3標準曲線的制作
分別取木糖溶液O．1、0．2…0．7ml于試管中補加檸檬酸緩沖液至2m1．再加3 mlDNS混勻．煮沸10min，取出冷卻后加水至25m1．以蒸餾水作空白．在540 nm處測OD值。可得到OD值與相應的木糖濃度的標準曲線．
1．4酶活力測定的一般方法
1 4．1粗酶液的制備 取出發(fā)酵后的酶液8000r/min離心5min．上清即為粗酶液。
1．4．2酶活力測定 取底物1mI于管中．據(jù)酶活大小加適量稀釋的粗酶液(要求最終測酶活時OD值在0．2加8之間)，補加檸檬酸緩沖液至2m1．50℃水浴反應30。in．加3mlDNS混勻，煮沸lOmIM，取出冷卻后加水至25m1．在540nm處測OD值。以每分鐘產(chǎn)生lUmol分子木糖的酶量作為一個酶活單位。
l 5制定因素位級表
根據(jù)預備試驗，選定pH值、反應溫度和反應時間3個因素．每個因素取4個水平，本試驗不考察各因素問的交互作朋。選用正交表L16(45)，見表1。
|
表1 因素水平 | |||
|
水平 |
A |
B |
C |
|
pH值 |
溫度（℃） |
反應時間（min） | |
|
1 |
4 |
45 |
10 |
|
2 |
5 |
50 |
15 |
|
3 |
6 |
55 |
30 |
|
4 |
7 |
60 |
45 |
2結(jié)果和分析
2．1測定條什的正交試驗結(jié)果
表2 正交實驗結(jié)果
|
序號 |
A（PH值） |
B（溫度℃） |
C(反應時間min) |
酶活（IU） |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1.88 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
1.42 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
0.38 |
|
4 |
1 |
4 |
4 |
0.25 |
|
5 |
2 |
1 |
3 |
2.25 |
|
6 |
2 |
2 |
4 |
2.08 |
|
7 |
2 |
3 |
1 |
4.43 |
|
8 |
2 |
4 |
2 |
4.06 |
|
9 |
3 |
1 |
4 |
1.76 |
|
10 |
3 |
2 |
3 |
2.67 |
|
11 |
3 |
3 |
2 |
3.71 |
|
12 |
3 |
4 |
1 |
5.13 |
|
13 |
4 |
1 |
2 |
3.08 |
|
14 |
4 |
2 |
1 |
3.03 |
|
15 |
4 |
3 |
4 |
2.03 |
|
16 |
4 |
4 |
3 |
2.77 |
|
K1 |
3.93 |
8.97 |
14.47 |
|
|
K2 |
12.28 |
9.2 |
12.27 |
|
|
K3 |
13.27 |
10.55 |
8.07 |
|
|
K4 |
10.91 |
12.21 |
6.12 |
|
|
k 1 |
0.98 |
2.24 |
3.62 |
|
|
k 2 |
3.21 |
2.3 |
3.07 |
|
|
k 3 |
3.32 |
2.64 |
2.02 |
|
|
k 4 |
2.73 |
3.05 |
1.53 |
|
|
R |
2.34 |
0.81 |
2.09 |
|
根據(jù)正交試驗結(jié)果表2的極差R值可以得出，影響xYl905所產(chǎn)木聚糖酶活性的因素依次為A>C>B；即反應的nH值對酶活測定的影響最大，其次是反應時間．而反應溫度的各個k值較為接近極差很小。冉從表3的方差分析結(jié)果來看，pH值和反應時間遠遠大于n。是極顯著因素，而反應溫度的F值小于F一，在實驗選取的水平范圍內(nèi)不顯著。
表3 方差分析
|
方差來源 |
方差 |
自由度 |
均方 |
F比 |
優(yōu)化水平 |
|
A |
14.03 |
3 |
4.68 |
39** |
A3 |
|
B |
1.67 |
3 |
0.56 |
4.67 |
|
|
C |
10.93 |
3 |
3.64 |
0.33** |
C1 |
|
Se |
0.69 |
6 |
0.12 |
|
|
|
So |
27.32 |
|
|
|
|
注：Fom(3.6)=9.78，Fom(3.6)=4.76
2 2正交優(yōu)化水平分析
從圖l可以更直觀的看出，pH在第2、第3水平時酶活較高，在第3水平時達到最大，若pH偏大或偏小酶活都明顯下降；隨著反應時間的延長，酶活性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，當反應時間為第1水平時所測的酶活最高：而反應溫度呈緩慢上升趨勢，從此趨勢來看反應溫度還需要進一步優(yōu)化，此枯草芽孢桿菌木聚糖酶的最佳反應溫度可能更高。比較表2中的k值，選出最優(yōu)化水平組合為A3C1B4，即最適反應pH值為6．時間10min．溫度60℃。但由于B因素不皿著，可以不取優(yōu)化水平．即優(yōu)化水平組合·可寫為A3C1B。
2 3酶反應溫度的進一步優(yōu)化
將XYl905的木聚糖酶粗酶液分別在不同溫度下測酶活．隨著溫度的升高酶活力逐漸下降，在60％：時酶活力最高．為該酶的最適作用溫度(圖2)。
2．4酶的熱穩(wěn)定性
將木聚糖酶粗酶液分別在不同溫度下保溫1h．然后按優(yōu)化方法測定酶活力。以來保溫的酶活力作為100％。結(jié)果表明，在40-60℃保溫酶活力不僅沒有下降反ifli有所升高，可能是在保溫的較高溫度下酶顯得的更活潑，在加入底物之后能迅速發(fā)生反應．從而使所測酶活偏高；在70℃、80％保溫酶活力下降4％左右。
2．5酶的pH穩(wěn)定性
將粗酶液放在不同pH值的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖液中，40℃保溫2h按優(yōu)化方法測定酶活力．在pH7時對酶活性影響最小．在酸性條件下．酶活隨酸度的增加逐漸下降.
2 6金屬離子對酶活性的影響
將粗酶液放在hnM／l的不同金屬離子溶液中．40℃保溫2h按優(yōu)化方法測定酶活力。Ba2+對酶活有促進作川；Mn2+、K+、Zn2+對酶活有抑制作用．其中Mn2+的抑制作Hj最強，酶活下降14％：其它離子對酶活無明顯影響．
3討論
XYl905所產(chǎn)酶的最適測定條件為pH6．反應時間10min，反應溫度60~C，可初步判定此酶在偏酸性環(huán)境及較高溫環(huán)境下有較高酶活．有做飼料添加劑的潛力．另外，反應時間若是更短，酶活性會更高．但由于自動化程度不高，為了減小誤差仍選反應時問為10min。
此酶的熱穩(wěn)定性在已發(fā)表的木聚糖酶中可能是最好的．在80~C下保溫lh剩余酶活為96．44％：真菌生產(chǎn)的木聚糖酶耐熱性普遍較差．保溫1h半失活溫度在55~C左右．現(xiàn)用的飼用酶制劑巾木聚糖酶…]在85℃濕熱處理10rain剩余酶活為34．62％：由于此酶的熱穩(wěn)定性很好就可以保證在飼料加工的制粒過程中酶活性幾乎沒有損失．、
此酶對lmM／1的金屬離子不太敏感．而青霉菌所產(chǎn)酶在1mg/的濃度下受Cu2+的強烈抑制．剩余酶活為27．3％．因此不同來源的木聚糖酶對金屬離子的敏感程度有較大差異。
