固態(tài)發(fā)酵工藝是很古老的技術(shù)，從遠(yuǎn)古時(shí)代人們就已利用固態(tài)發(fā)酵制造食品、干酪和堆肥。隨著世界能源危機(jī)的出現(xiàn)和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，固態(tài)發(fā)酵工藝以其高產(chǎn)、簡(jiǎn)易、低投資、低能耗、高回收、無(wú)泡沫、需控參數(shù)少、無(wú)或少環(huán)境污染等突出優(yōu)點(diǎn)再次引起人們的興趣。固態(tài)發(fā)酵現(xiàn)已在眾多的領(lǐng)域得到應(yīng)用，如在治理環(huán)境方面，在生物飼料生產(chǎn)領(lǐng)域等。利用固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行各種酶類的生產(chǎn)已經(jīng)成為常用的技術(shù)手段。生產(chǎn)的酶類如下：① 纖維素酶：纖維素酶系一般包括三種水解酶，即內(nèi)切葡聚糖酶(Cx ）、外切葡聚糖酶（C1 ）、β一葡萄糖苷酶（βG ）。C1酶可作用于不溶性纖維素表面，使結(jié)晶纖維素鏈開裂，長(zhǎng)鏈纖維素分子末端部分游離，從而使纖維素鏈易于水化；Cx 酶是進(jìn)一步作用于經(jīng)C1酶活化的纖維素，可分解β一1 , 4 一鍵，生成纖維二糖，纖維三糖；那酶是作用于纖維二糖，纖維三糖，最終使之分解為葡萄糖，纖維素就是在這三種酶的共同作用下被水解的。因此，纖維素酶在食品、飼料、農(nóng)副產(chǎn)品加工、石油開采和資源再利用等方面具有廣泛的用途和應(yīng)用前景；② 木質(zhì)素酶：木質(zhì)素酶作用是一種非專一性的以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過(guò)程。木質(zhì)素酶不僅對(duì)木質(zhì)素，而且對(duì)許多種類的有機(jī)物尤其是人工合成的有機(jī)污染物都有很強(qiáng)的降解能力，而且具有高效、低耗、高適用性等特點(diǎn)；③ 半纖維素酶：半纖維素酶是分解半纖維素的一類酶的總稱，主要作用是降解畜禽消化道內(nèi)的非淀粉多糖，降低腸道內(nèi)容物的豁性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，減少畜禽下痢，木聚糖酶是其中的一種。木聚糖酶是一種復(fù)合酶，包括β-1 , 4 一木聚糖酶和β－木糖苷酶。前者主要以主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，將大分子木聚糖降解成寡聚木糖、木二糖及少量木糖，后者作用于木寡糖或木二糖末端，釋放出木糖；④ 其他酶類：果膠酶是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。廣泛應(yīng)用于果汁，果酒的澄清等；聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的重要組分，它專一性的分解果膠質(zhì)中兩個(gè)非酷化半乳糖醛酸間的糖昔鍵。a 一轉(zhuǎn)移葡萄糖昔酶可以從低聚糖類底物的非還原性末端切開a 一1 , 4 一糖苷鍵，釋放出葡萄糖或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以a 一1 , 6 一糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物上，從而得到低聚異麥芽糖、糖脂或糖膚等。
1 產(chǎn)纖維素酶的菌種及其發(fā)酵條件研究
1．1 木霉及其固態(tài)發(fā)酵條件研究
木霉菌屬于半知菌亞門，絲抱綱，絲飽目，勃抱菌類，是一類普遍的真菌。采用固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，液料比在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中是對(duì)產(chǎn)酶影響最大的因素，溫度在發(fā)酵初期影響最大，初始pH 值和接種量的影響不顯著。從眾多研究中得出，培養(yǎng)溫度、初始pH 值、液料比和接種量分別是30 ℃ 、4 、7 和5 ％是比較合適的。
1 . 1 . 1 綠色木霉（Trichoderma viride ）及其發(fā)酵條件綠色木霉是木霉中具有重要經(jīng)濟(jì)意義的一種，在自然界分布廣，所產(chǎn)生的纖維素酶具極高降解力。影響纖維素酶產(chǎn)量和酶活的因素很多，除菌種本身的個(gè)體差異外，培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件是影響發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素。戴四發(fā)等在研究綠色木霉產(chǎn)纖維素酶特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中碳源及其一些物質(zhì)對(duì)纖維素酶復(fù)合系中各組分的分泌呈現(xiàn)不同的規(guī)律：分別以纖維素粉或麥鼓為惟一碳源時(shí)，Cx 酶最早呈現(xiàn)最高酶活，而按比例混合作為碳源時(shí)則各酶組分較一致的呈現(xiàn)最高酶活形式。姜緒林等在通過(guò)麥角固醇測(cè)定綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)的纖維素酶的生物量的同時(shí)，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了初步優(yōu)化，獲得了最佳培養(yǎng)基組分：碳源為蔗糖，無(wú)機(jī)氮為硫酸錢時(shí)，水料比2 . 2 : 1 , pH 5 . 5 ，用該培養(yǎng)基得到的經(jīng)甲基纖維素酶活（CMC 酶活）和濾紙酶活分別比優(yōu)化前提高了21 . 0 ％和44 . 1 % ；陳書峰等以稻草和數(shù)皮的混合物為主料，研究發(fā)現(xiàn)稻草經(jīng)4 % , 40 ℃ 的氫氧化鈉溶液浸泡24h 后以30 ％質(zhì)量比添加到鼓皮中發(fā)酵，濾紙酶活和CMC 酶活比未經(jīng)處理組提高了27 . 5 ％和25 . 6 % ，最終優(yōu)化發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30 ℃ ，接種量20 % ，培養(yǎng)基初始含水量45 % - 60 % ，此時(shí)濾紙酶活和CMC 酶活可達(dá)5 ．15IU · g-1，（干物質(zhì)）和38 . 46 IU · g -1，（干物質(zhì)）。徐春厚對(duì)綠色木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶優(yōu)化條件研究表明，培養(yǎng)基中稻草粉和熬皮比例1 . 5 : 1 ，料水比1 : l . 5 ，氮源為2 . 2 ％一2 . 5 ％的硫酸銨，起始pH 6 . 0 一6 . 5 , 250 mL 三角瓶中裝培養(yǎng)基15 – 20g，培養(yǎng)60h ，室溫下發(fā)酵可獲得最高酶活。
1 , 1 . 2 康氏木霉（Trichoderma koningii）及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究
石長(zhǎng)波等對(duì)脫脂豆粕和氨化大豆秸稈固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行產(chǎn)酶研究得出，影響康氏木霉固態(tài)發(fā)酵的主要因素為溫度、pH 值、培養(yǎng)基液料比及其培養(yǎng)時(shí)間，比較適宜的具體條件是30 ℃ ，pH 4 . 5 一5 ，液料比2 . 5 : 1 ，發(fā)酵4d ，纖維素酶活為7 . 98U · g-1。姜秋會(huì)等以鼓皮和玉米芯為主要原料研究了碳源和表面活性劑對(duì)康氏木霉產(chǎn)纖維素酶活的影響，結(jié)果表明，碳源以數(shù)皮：玉米芯為3 : 2 時(shí)最佳，表面活性劑以奇強(qiáng)洗潔精對(duì)提高纖維素酶活力作用最顯著，用量0 . 5 ％時(shí)酶活力比對(duì)照提高了12 . 4 ％。
1 . 1 . 3 里氏木霉（Triohoderma reesei）及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究
里氏木霉是一種高產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌，它對(duì)人無(wú)毒性，在產(chǎn)酶條件下也不產(chǎn)生真菌毒素和抗生素。里氏木霉因其纖維素酶產(chǎn)量較高，易于培養(yǎng)和控制，產(chǎn)纖維素酶穩(wěn)定性好，產(chǎn)生的胞外纖維素酶易于分離純化，培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物安全無(wú)毒等特點(diǎn)，常作為生產(chǎn)纖維素酶的菌種。范志華等在關(guān)于里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵方式的研究中發(fā)現(xiàn)，固體發(fā)酵培養(yǎng)方式分為靜置培養(yǎng)和翻拌培養(yǎng)，把固體發(fā)酵培養(yǎng)基按10 ％裝瓶量裝入250 mL 錐形瓶中，5 ％接種量，28 - 30 ℃ 進(jìn)行靜置和翻拌兩種方式分別培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)固態(tài)發(fā)酵翻拌培養(yǎng)時(shí)酶活較高。丁重陽(yáng)等利用里氏木霉固態(tài)發(fā)酵麥糟：玉米芯為4 : l 生產(chǎn)纖維素酶，在淺盤固態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)上對(duì)固態(tài)發(fā)酵規(guī)模適當(dāng)放大（20 倍），在曲箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取得了較好效果，在發(fā)酵前期（24h ）品溫控制在28 一33 ℃ 之間，中期（24 一60h ) 40 ℃ 以下，發(fā)酵后期35 ℃ 以下，干曲最高酶活可達(dá)430U · g -1，，同時(shí)證實(shí)采取液體種子，大接種量可有效防止發(fā)酵前期雜菌污染。研究證實(shí)影響酶活力的關(guān)鍵因素是培養(yǎng)基水分及接種時(shí)間，另外纖維素的量與結(jié)構(gòu)也是一個(gè)重要因素。
1.2 曲霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件研究復(fù)合纖維素酶產(chǎn)生菌除木霉外，還有曲霉菌。
1 . 2 . 1 黑曲霉（Aspergillus niger）及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究
黑曲霉不產(chǎn)生毒素，現(xiàn)已被許多國(guó)家批準(zhǔn)作為食品用酶制劑生產(chǎn)菌，國(guó)外已實(shí)現(xiàn)黑曲霉制劑商品的工業(yè)化生產(chǎn)。利用黑曲霉生產(chǎn)復(fù)合纖維素酶要求培養(yǎng)基含不同原料來(lái)誘導(dǎo)酶產(chǎn)生，以提供必需的氮碳源等營(yíng)養(yǎng)條件。靖德兵等應(yīng)用雙溫度培養(yǎng)法（前30h 恒溫30 ℃ ，后續(xù)72h 恒溫23 ℃ ）進(jìn)行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，自然補(bǔ)給氧氣，培養(yǎng)基pH 6 . 5 并保持環(huán)境濕度60 ％條件下證實(shí)：葡萄糖對(duì)濾紙酶活有促進(jìn)作用；葡萄糖、數(shù)皮、硫酸按、水分適宜作為培養(yǎng)基基本組分，表面活性劑吐溫一80 對(duì)纖維素酶活力促進(jìn)效果不明顯。
1 . 2 . 2 米曲霉（Aspergillus oryzae）及其發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究
米曲霉同黑曲霉一樣可產(chǎn)生纖維素酶，尤其是產(chǎn)生戶葡萄糖昔酶。在生產(chǎn)中，人們利用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的戶葡萄糖昔酶可將糖昔型異黃酮酶解為異黃酮苷元，旨在開發(fā)抗氧化劑。以豆渣為基質(zhì)，加人10 ％乳酸調(diào)節(jié)酸度，進(jìn)行米曲霉固態(tài)發(fā)酵。在研究各因子的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣提取物的抗氧化性影響最顯著，培養(yǎng)溫度次之，乳酸添加量影響最小，最終得出發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間4d ，溫度30 ℃ 。
2 產(chǎn)木聚糖酶的菌種及其發(fā)酵條件研究
木聚糖是半纖維素的主要成分，廣泛應(yīng)用于植物界，許多谷物飼料中存在的木聚糖是阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化的抗?fàn)I養(yǎng)因子，使飼料消化利用率大大降低。為此，能高效降解木聚糖的木聚糖酶的研究開發(fā)和應(yīng)用受到了各國(guó)重視。固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶工藝可操作性強(qiáng)，易于中小企業(yè)推廣應(yīng)用。
2 . 1 黑曲霉生產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件研究
黑曲霉是生產(chǎn)木聚糖酶使用最多的菌種。禹慧明等探索了黑曲霉生產(chǎn)木聚糖酶的固體發(fā)酵條件，經(jīng)優(yōu)化獲得了高酶活的發(fā)酵產(chǎn)物，并研究了發(fā)酵產(chǎn)物的主要酶系組成，實(shí)驗(yàn)證實(shí)尿素、磷酸二氫鉀及含水量是影響酶活的主要因素。篩選一株木聚糖酶活力較高的黑曲霉菌株，研究其適宜的培養(yǎng)條件為：起始pH 4 . 8 , 28 ℃ 下抱子懸液接種量10 % , 玉米秸粉：鼓皮為6 : 4 ，培養(yǎng)72h ，木聚糖酶活可達(dá)2 650IU · g -1。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH 值及發(fā)酵時(shí)間對(duì)木聚糖酶活影響較大。對(duì)黑曲霉固態(tài)發(fā)酵飼用復(fù)合酶活的分析表明黑曲霉可產(chǎn)生含有木聚糖酶、葡聚糖酶等多種酶的復(fù)合酶系，該酶系適用于添加在牛羊等反當(dāng)動(dòng)物飼料內(nèi)。通過(guò)對(duì)黑曲霉在曲盤中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶中試條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基中數(shù)皮與玉米芯比例為6 : 4 ，添加硫酸錢可促進(jìn)黑曲霉菌絲體生長(zhǎng)，而對(duì)酶活沒(méi)有顯著影響，最適起始pH 4 . 0 ，培養(yǎng)厚度4 cm , 28 ℃ 培養(yǎng)60 - 84h 。對(duì)篩選的高產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株AN27 一2 一1進(jìn)行單因子和正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在培養(yǎng)基組分為啤酒糟：玉米芯：麩皮＝6 : 2 : 2 ，硫酸銨2 % ，吐溫一80 為0 . 1 % ，加水比l : 2 ，接種量3 . 5 % ，培養(yǎng)溫度30 ℃ ，培養(yǎng)2 一3d ，酶活可達(dá)3 10.54U.g-1 。
2 . 2 其他霉菌產(chǎn)木聚糖酶研究
熊濤等以稻草和鼓皮為主要基質(zhì)，對(duì)里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究表明，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加數(shù)皮不利于產(chǎn)木聚糖酶，最適氮源為硫酸錢，料水比1 : 3 . 5 ，并分析了無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響：MgSo4 · 7H2O＞Mnso4 · H2O＞ZnSo4 · H2O＞Fes04 · 7H2O 。宇佐美曲霉產(chǎn)木聚糖酶的最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為：鼓皮3 . 49 ，玉米芯4 . 69 ，硝酸錢1 % ，磷酸二氫鉀0 . 3 % ，氯化鈣0 . 1 % ，硫酸鎂0 . 1 % ，吐溫一80 為0 . 4 % ，液料比1 . 2 : 1 ，自然pH 值，28 ℃ 培養(yǎng)72h ，其間翻曲2 一3 次，干曲酶活可達(dá)7 442lU · g-1。篩選的一株高產(chǎn)木聚糖酶及纖維素酶的青霉菌（Peni 。illium 。mersonii ）的最佳培養(yǎng)條件為：起始pH 4.6 ，發(fā)酵溫度29 ℃ ，每克固體培養(yǎng)基接種量lmL 孢子懸液（孢子2 . 5x107.mL-1) , 玉米芯：麩皮為7 : 3 ，尿素為氮源，發(fā)酵3 天，木聚糖酶酶活可達(dá)4 236 U . g -1。
3 其他酶的生產(chǎn)
3 . 1 聚半乳糖醛酸酶的生產(chǎn)
聚半乳糖醛酸酶是果膠酶的重要組分，現(xiàn)研究也相對(duì)較多，主要應(yīng)用菌為黑曲霉。利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶，培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃ ，起始pH 6 . 0 ，接種量1 . 0 mL ，培養(yǎng)72h , 最高酶活達(dá)2 695U · g -1，（鮮曲），添加果膠粉或含果膠豐富的果皮粉可明顯促進(jìn)酶的生產(chǎn)，葡萄糖對(duì)酶的合成無(wú)抑制作用。
3 . 2 β一甘露聚糖酶的生產(chǎn)
β-甘露聚糖酶是一類能水解含有β-1 , 4 一D - 甘露聚糖苷鍵甘露聚糖的水解內(nèi)切酶，屬于半纖維素酶。該酶已在各個(gè)行業(yè)得到應(yīng)用。李江華等以黑曲霉為生產(chǎn)菌種發(fā)酵生產(chǎn)酸性β一甘露聚糖酶，較適宜的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為：鼓皮10g ，魔芋粉0 . 4g ，豆餅粉1 . 5g ，硫酸按0 . 2g ，起始濕度55 % ，自然pH 值，35 ℃ 發(fā)酵％h ，干曲酶活達(dá)95oU · g -1。
3 . 3 蛋白酶的生產(chǎn)
固態(tài)發(fā)酵技術(shù)不僅可生產(chǎn)菌體蛋白飼料，同時(shí)在蛋白酶生產(chǎn)中也頗具優(yōu)越性。杜連祥等利用里氏木霉生產(chǎn)的一種絲氨酸類蛋白酶（t 一PA ) ，具有高效、特異的溶栓作用，通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得的固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基為：麩皮（30 目篩）10g ，葡萄糖0 ．15g , 胰蛋白膝0 ．15g ，可溶性纖維素0 . 3g ，加營(yíng)養(yǎng)液10 mL ；適宜的培養(yǎng)條件是：250 mL 三角瓶中裝發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基50g , 10 ％接種量，31 ℃ 培養(yǎng)84h , 可達(dá)到產(chǎn)酶高峰。米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶同樣是一個(gè)典型的發(fā)酵過(guò)程。米曲霉在發(fā)酵產(chǎn)酶階段，發(fā)酵12h 后米曲霉開始分泌蛋白酶，當(dāng)?shù)?7h 時(shí)分泌的酶量達(dá)最大，同時(shí)證實(shí)米曲霉菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中伴隨蛋白酶的分泌，可根據(jù)蛋白酶的產(chǎn)生判斷菌絲體生長(zhǎng)狀況，濕度與溫度對(duì)酶的影響趨勢(shì)相同。
4 結(jié)語(yǔ)
固態(tài)發(fā)酵已逐漸成為生產(chǎn)酶的主要技術(shù)手段之一，然而在人們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的過(guò)程中，筆者認(rèn)為尚存在以下幾個(gè)問(wèn)題：① 各種發(fā)酵產(chǎn)酶研究技術(shù)缺乏系統(tǒng)性、深人性，都局限在實(shí)驗(yàn)室階段，很少能體現(xiàn)出規(guī)模化生產(chǎn)的應(yīng)用價(jià)值；② 各類研究報(bào)道比較松散，同時(shí)由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)差異顯著，缺乏可比性；③ 各類研究實(shí)驗(yàn)以測(cè)酶活居多，以產(chǎn)酶量作為指標(biāo)研究不多；④ 在菌種應(yīng)用方面，很少有統(tǒng)一菌株的系列報(bào)道，各個(gè)研究都比較孤立，多數(shù)為研究者自選的菌株，而對(duì)該菌株的生理生化特性報(bào)道極少，缺乏菌株方面的參考數(shù)據(jù)。
