博特美^TMβ-甘露聚糖酶（1）

新型酶制劑――β-甘露聚糖酶研究進(jìn)展

植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。甘露聚糖是植物半纖維素的重要組分，是由β-1,4-D-甘露糖連接而成的線狀多聚體，在多糖的側(cè)鏈上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基團(tuán)，圖1為甘露聚糖的分子結(jié)構(gòu)示意圖。甘露聚糖具有高親水性，在單胃動(dòng)物的消化道內(nèi)大量吸水，增加了消化道內(nèi)容物的粘度，抵抗胃腸的蠕動(dòng)，直接影響動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。近年來，隨著豆類產(chǎn)品（豆粕等）在動(dòng)物飼料中的廣泛應(yīng)用，甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用也越來越受到重視，在飼料中添加酶制劑是解決這一問題的主要途徑。甘露聚糖的完全酶解需要β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）、β-甘露糖苷酶(EC3.2.1.25)、 β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)和脫乙酰酶(EC3.1.1.6)的協(xié)同作用，其中β-甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用比較廣泛。

1.  β-甘露聚糖酶的來源和酶學(xué)性質(zhì)研究

β-甘露聚糖酶廣泛存在于自然界中，在一些低等動(dòng)物（如海洋軟體動(dòng)物Littorina brevicula）的腸道分泌液中、某些豆類植物（如長(zhǎng)角豆、瓜兒豆等）發(fā)芽的種子中以及天南星科植物魔芋萌發(fā)的球莖中都發(fā)現(xiàn)了β-甘露聚糖酶酶活的存在。而微生物（包括真菌、細(xì)菌和放線菌等）則是飼用β-甘露聚糖酶的主要來源， 各種微生物產(chǎn)生β-甘露聚糖酶的條件和所產(chǎn)酶活性的高低、酶的性質(zhì)和作用方式以及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)等均有所不同。微生物來源的β-甘露聚糖酶具有活性高、成本低、提取方便以及比動(dòng)植物來源的有更廣的作用pH 值、溫度范圍和底物專一性等顯著特點(diǎn)，備受研究者的重視，其中，細(xì)菌中的芽孢桿菌、假單胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、青霉、酵母、木霉和放線菌中的鏈霉菌等產(chǎn)的β-甘露聚糖酶等研究的較多，表1中列出了部分微生物產(chǎn)的β-甘露聚糖酶及其酶學(xué)特性。

目前，已有許多不同來源的β-甘露聚糖酶獲得了純化，如田新玉（1993）首先報(bào)道了嗜堿性芽孢桿菌Bacillus sp.N16- 5 產(chǎn)生的3 種胞外堿性β-甘露聚糖酶。楊文博（1995）、余紅英（2003）、吳襟（2000）分別對(duì)地衣芽孢桿菌Bacillus lichienoformis NK- 27產(chǎn)生的堿性β-甘露聚糖酶、枯草芽孢桿菌SA-22產(chǎn)生的中性β-甘露聚糖酶、諾卡氏菌形放線菌Nocardioform actinomycetes NA3- 540C 產(chǎn)生堿性β-甘露聚糖酶的純化及性質(zhì)作了報(bào)道。在真菌方面，田亞平（1998）、王和平（2003）分別就黑曲霉WX- 96所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶、里氏木酶RutC-30 所產(chǎn)的酸性β-甘露聚糖酶進(jìn)行了酶純化和性質(zhì)研究。國(guó)外Ademark （1998） 和Yosida（1997）分別報(bào)道了黑曲霉、環(huán)狀芽孢桿菌β-甘露聚糖酶的純化和性質(zhì)。不同微生物所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶的分子質(zhì)量、最適反應(yīng)pH、等電點(diǎn)、最適反應(yīng)溫度、酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)、底物專一性等都有一定的差異。β-甘露聚糖酶的分子質(zhì)量小的只有22 kDa，大的可以達(dá)到162 kDa，相差十分懸殊，但大部分在30 kDa～55 kDa。

表1. 部分微生物產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶及其性質(zhì)

圖1 枯草芽孢桿菌 

圖2  假單胞菌

真菌來源的β-甘露聚糖酶的作用范圍偏酸，一般在pH 4.0～5.5之間，最適反應(yīng)溫度一般在55℃～75℃。如1990年Johnson K G研究的里氏木霉的甘露聚糖酶，最適pH為5.5，最適反應(yīng)溫度為65 ℃；李江華等研究的黑曲霉的甘露聚糖酶，最適pH為5.5，最適反應(yīng)溫度為35℃。細(xì)菌和放線菌來源的甘露聚糖酶最適作用pH卻常為中性或者偏堿性，最適反應(yīng)溫度為45℃～70℃。細(xì)菌中，研究最多的是芽孢桿菌，除嗜堿芽孢桿菌高至pH 9.0以上之外，最適反應(yīng)pH多為5.5～7.0。馬建華等研究的枯草芽孢桿菌最佳反應(yīng)pH為6.4，最適反應(yīng)溫度為50℃。總之，真菌來源的β-甘露聚糖酶作用偏酸性，而細(xì)菌和放線菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶作用的pH近中性或偏堿性，且穩(wěn)定性較好。單胃動(dòng)物飼料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的，國(guó)內(nèi)外對(duì)來源于不同菌種的β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)有所報(bào)道，但多集中在堿性和中性β-甘露聚糖酶方面，而關(guān)于酸性β-甘露聚糖酶的微生物發(fā)酵生產(chǎn)國(guó)內(nèi)很少有報(bào)道，因此，對(duì)酸性β-甘露聚糖酶的研究及進(jìn)行工業(yè)化推廣將在飼料工業(yè)中具有較大的應(yīng)用潛力。

利用分子生物學(xué)手段，可以開發(fā)生產(chǎn)酶活性高、適應(yīng)性強(qiáng)的微生物菌種。β-甘露聚糖酶分子生物學(xué)的研究進(jìn)展較快，到目前為止有Rhodothermus marinus（Politz等，2000）、Dictyoglomus thermophilum Rt46B1（Gibbs等，1999）、Aspergillus aculeatus（Christgau 等，1994）、Bacillus stearothermophilus（Ethier等，1998）、西紅柿種子（Bewley 等，1997）等多種微生物和動(dòng)植物的β-甘露聚糖酶基因先后被克隆和表達(dá)，這些為開發(fā)新的、能滿足飼料工業(yè)需要的產(chǎn)酶菌提供了條件。

2.  β-甘露聚糖酶的作用方式及其水解產(chǎn)物

β-甘露聚糖酶是水解1，4-β-D-吡喃甘露糖為主鏈的內(nèi)切水解酶，作用底物主要是半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖以及甘露聚糖。不同來源的β-甘露聚糖酶對(duì)不同來源的底物作用深度及其水解產(chǎn)物是不相同的。β-甘露聚糖酶水解底物的方式和深度主要與α-半乳糖殘基和葡萄糖殘基在主鏈中的位置、含量、酯酰化的程度有關(guān)。底物本身的物理狀態(tài)也會(huì)影響酶對(duì)底物的作用，如結(jié)晶狀態(tài)的甘露聚糖不易被降解。甘露聚糖經(jīng)β-甘露聚糖酶作用后，通過HPLC或紙層析方法分析，主要產(chǎn)物是寡聚糖（一般2～10個(gè)殘基），產(chǎn)物聚合度的大小與酶和底物的來源有關(guān)（McCleary，1988；田新玉等，1993；楊文博等，1995；Arison- Atac等，1993），但相對(duì)來說產(chǎn)生單糖（甘露糖）很少或根本不產(chǎn)生。寡聚糖是一種新型的功能性低聚糖；能明顯地促進(jìn)人體和動(dòng)物腸道內(nèi)有益菌——雙歧桿菌的增殖，改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)是一種很好的雙歧因子。

3.  β-甘露聚糖酶的分子生物學(xué)研究

關(guān)于酶的分子特征和催化機(jī)制方面的研究報(bào)道還很少。吳襟等利用化學(xué)修飾的方法對(duì)諾卡氏菌形放線菌產(chǎn)的甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了初步研究，證明了酶蛋白的巰基、酪氨酸殘基及色氨酸殘基是維持酶活性必需的基團(tuán)。進(jìn)一步研究證實(shí)蛋白內(nèi)部的二硫鍵是影響該酶熱穩(wěn)定性的重要因素。Cann等從Thermoanaerobacterium  polysaccharolyticum中克隆到一種高分子量（119.6kDa）甘露聚糖酶，缺失突變證明了該酶含有兩個(gè)纖維素結(jié)合區(qū)和一個(gè)催化功能區(qū)。

4.  β-甘露聚糖酶的應(yīng)用研究

4.1  β-甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用研究

豆類、谷類及其副產(chǎn)品中普遍存在著一種抗?fàn)I養(yǎng)因子——β-D-甘露聚糖，因不能被單胃動(dòng)物消化，降低了飼料的利用率。β-甘露聚糖酶具有能分解β-D-甘露聚糖，降低消化道內(nèi)容物黏度；破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能與消化酶充分接觸；提高動(dòng)物內(nèi)源酶(如淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等)的活性；改善腸道微生物菌群和提高腸黏膜的完整性等功能。加入β-甘露聚糖酶能分解β-甘露聚糖，使之轉(zhuǎn)化為甘露低聚糖，從而降低β-甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料的利用率，促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，減輕環(huán)境的污染。另外，β-甘露聚糖酶分解β-D-甘露聚糖生成的甘露低聚糖，能吸附病原菌、促進(jìn)腸道有益菌群的增殖，提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。長(zhǎng)期使用可防止沙門氏菌、肉毒桿菌等致病菌的感染、在腸道的繁殖和定植，減少抗生素的添加量。

β-甘露聚糖酶能降解飼料中的甘露聚糖，不僅消除了甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時(shí)生成的甘露寡糖在動(dòng)物生產(chǎn)中起著重要的作用。Dvorak的試驗(yàn)證實(shí)，甘露寡糖能提高仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，其原因可能是其提高了仔豬的免疫力，抑制了病原菌在胃腸道的增值。甘露寡糖具有一定的免疫原性，能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，而且與病毒、毒素結(jié)合，減緩抗原的吸收，能夠調(diào)節(jié)腸道的菌群，干擾病原菌的定植。近年來關(guān)于甘露寡糖吸附霉菌毒素的研究也越來越受到人們的重視。Trenholm研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可結(jié)合玉米赤霉烯酮，通過物理吸附或直接結(jié)合霉菌毒素，且不影響其他飼料成分。

研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖能夠顯著提高無菌仔豬血清和腸粘膜中IgA、IgG和IgM的含量及血液中白細(xì)胞

介素-2的水平，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞功能和小腸原始淋巴細(xì)胞的活性，增強(qiáng)小腸內(nèi)白細(xì)胞的吞噬能力和促進(jìn)淋巴細(xì)胞釋放IFN-γ細(xì)胞素。邵良平等報(bào)道，甘露寡糖能極顯著提高仔豬白細(xì)胞分化抗體CD₃的水平。

胃腸道非免疫防御系統(tǒng)主要組成成分為內(nèi)源微生物群，而內(nèi)源微生物群又常分為有益微生物群（如雙歧桿菌屬、真桿菌屬、乳酸桿菌屬）和有害微生物群（如大腸桿菌屬。產(chǎn)氣夾膜梭菌屬、葡萄球菌屬）。研究表明，甘露寡糖能調(diào)控動(dòng)物胃腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，抑制有害菌對(duì)腸道的粘附和定植。維持正常的消化道環(huán)境。 Sisak在日糧中添加0.1%的甘露寡糖，仔雞盲腸、胴體沙門氏菌的檢出率分別降低58%和56%。Spring 報(bào)道，甘露寡糖能加強(qiáng)豬對(duì)沙門氏菌、溶血性大腸桿菌和彎桿菌等感染的免疫應(yīng)答。

目前，國(guó)內(nèi)外規(guī)模化生產(chǎn)甘露聚糖酶的企業(yè)有美國(guó)的ChemGen、丹麥novozyme、北京博仕奧生物技術(shù)有限公司等。

β-甘露聚糖酶在單胃動(dòng)物體內(nèi)的作用位點(diǎn)決定了飼料中使用的β-甘露聚糖酶要求是酸性的（如表2）。

表2    β-甘露聚糖酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用位點(diǎn)

Jackson等研究表明，β-甘露聚糖酶能提高玉米-豆粕型日糧雞的飼料轉(zhuǎn)化率，并促進(jìn)肉雞及火雞的日增重和飼料利用率，提高蛋雞的生產(chǎn)性能。在產(chǎn)蛋初期的前12周，在飼料中添加β-甘露聚糖酶，雞蛋的平均重量可增加約0.3g／只；產(chǎn)蛋期的第12周到第24周，可使蛋雞的日產(chǎn)蛋量提高 0.7％～1.07％；24周以后添加，日產(chǎn)蛋量可增加約1.5％。研究也表明，β-甘露聚糖酶能增加產(chǎn)蛋初期雞蛋的重量，可延遲高峰后期的產(chǎn)蛋率的下降。肉雞的研究數(shù)據(jù)顯示，β-甘露聚糖酶可提高肉雞的日增重和飼料利用率。王春林等報(bào)道，低能量飼料添加β-甘露聚糖酶可以提高飼料的轉(zhuǎn)化率。并且，日糧中添加β-甘露聚糖酶可通過內(nèi)分泌和免疫調(diào)節(jié)途徑提高雞的抗病力，改善肉雞的健康狀況。李國(guó)勝等報(bào)道，試驗(yàn)組(基礎(chǔ)日糧中添加0.05%β-甘露聚糖酶)體質(zhì)量變系數(shù)為10%，對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）體質(zhì)量的變異系數(shù)為14%。

在飼料中添加β-甘露聚糖酶，可顯著提高豬的采食量、飼料利用率、日增重；日糧粗纖維含量相同時(shí)，在飼料中添加β-甘露聚糖酶可減少豬糞的排泄量。Pettey等研究表明，在仔豬階段，日糧添加β-甘露聚糖酶，能顯著提高仔豬的采食量，促進(jìn)飼料利用率，提高仔豬的生長(zhǎng)速度和日增重，使豬的生長(zhǎng)性能得到很大的提高。飼料中添加β-甘露聚糖酶能顯著提高豬對(duì)于粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、無氮浸出物的消化能力，也可提高飼料的消化能。在豬的整個(gè)飼養(yǎng)階段日糧添加β-甘露聚糖酶，日飼料消耗量、料肉比、飼養(yǎng)周期都得到明顯的降低，平均日增重有了很大的提高。黃小文等報(bào)道，大豬日糧中分別添加1000U/g和2000U/g甘露聚糖酶比對(duì)照組平均日增重分別提高6.22%和12.99%。

4.2　在食品行業(yè)中的應(yīng)用

β-甘露聚糖酶能夠水解甘露聚糖，葡甘露聚糖，半乳糖甘露聚糖和半乳糖葡甘露聚糖生成甘露低聚糖。

甘露低聚糖作為雙歧桿菌的增殖因子，可有效地使體內(nèi)有益菌自然 增殖、改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)腸道消化系統(tǒng)功能，因此甘露低聚糖具有保肝、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、加強(qiáng)腸道蠕動(dòng)、降低膽固醇、抗衰老等生理活性，適用于各種腸道疾病，同時(shí)也適合于健康人特別是老年人和兒童的日常保健，再加上甘露低聚糖具有優(yōu)良的甜味品質(zhì)，可替代蔗糖，用于飲料、糖果、餅干、果脯和乳制品等食品中，是一種良好的食品添加劑，國(guó)外已廣泛應(yīng)用于保健品中。因此在食品中添加一定量的β-甘露聚糖酶，可降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)的蓄積，改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

魔芋膠為葡萄甘露聚糖，經(jīng)β-甘露聚糖酶作用后形成一系列的低聚糖。試驗(yàn)證明，魔芋膠的酶解物能有效地改善腸道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，且其性能及效果優(yōu)于大豆低聚糖及半乳糖基轉(zhuǎn)移低聚糖。同時(shí)魔芋低聚糖對(duì)防治高血脂癥、預(yù)防動(dòng)脈硬化和冠心病的發(fā)生有一定作用。近年來發(fā)現(xiàn)，低聚糖對(duì)動(dòng)物健康和生產(chǎn)機(jī)能的促進(jìn)作用就某些方面來說，并不亞于抗生素，且為綠色食品，因而低聚糖不論作為功能性食品或是作為動(dòng)物飼料添加劑均具有廣闊的市場(chǎng)前景。我國(guó)是魔芋生產(chǎn)國(guó)，魔芋資源豐富，開發(fā)我國(guó)甘露低聚糖將有較大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

 圖3   魔芋

圖4  發(fā)酵設(shè)備