關(guān)鍵詞：高產(chǎn)菌株；pH值；溫度；復(fù)合酶
微生物的新陳代謝過程與產(chǎn)酶過程是相伴隨的，產(chǎn)酶的過程要求要在一定的條件下才能完成。良好的外界環(huán)境有利于酶的形成，比如合適的溫度、通氣、pH和營(yíng)養(yǎng)條件等。酶是良好的生物催化劑，合適的外界條件能夠加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行。探討酶促反應(yīng)條件是合理使用酶制劑的前提，也是合理使用酶制劑所必須的。
1 材料和方法
1.1 菌株
木素木霉S6-5，黑曲霉Y7-6，枯草芽孢桿菌B5-12。
1.2 培養(yǎng)基
麩皮70g、豆粉5g、玉米粉9g、稻草粉3g、硝酸銨1g、營(yíng)養(yǎng)鹽10%，含水量65%～75%，滅菌備用。
1.3 酶液提取
選用S6-5、Y7-6和B5-12菌株發(fā)酵，發(fā)酵溫度32℃、初始pH=5.0、接種量10%、發(fā)酵時(shí)間84h?；炀壤?∶2∶1的條件下進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物于40℃下烘干，粉碎成粗粉狀，混勻待用。稱取干酶曲1g，加入15mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液浸提1h，過濾得到粗酶液，用相同的緩沖液適當(dāng)稀釋測(cè)定酶活。
1.4 酶活測(cè)定
1.4.1 CMC酶活力的測(cè)定（DNS法）
以CMC-Na作為反應(yīng)底物，在一定溫度、pH值等條件下發(fā)生酶促反應(yīng)，以反應(yīng)液中還原糖的增加量表示酶活力。CMC酶活力的定義：一定的pH值和溫度條件下，每克樣品每分鐘分解CMC-Na生成1μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U/g）。
1.4.2 蛋白酶活力的測(cè)定（福林試劑法）
以酪蛋白為底物，在一定溫度、pH值等條件下發(fā)生酶促反應(yīng)，以反應(yīng)液中酪氨酸的增加量表示酶活力。蛋白酶活力的定義：在一定的溫度和pH值條件下，每克樣品每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)蛋白酶活力單位（U/g）。
1.4.3 淀粉酶活力的測(cè)定（DNS法）
以淀粉為底物，在一定溫度、pH值等條件下發(fā)生酶促反應(yīng)，以反應(yīng)液中還原糖的增加量表示酶活力。淀粉酶活力的定義：在一定的溫度和pH值條件下，每克樣品每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1mg麥芽糖所需的酶量為1個(gè)淀粉酶活力單位（U/g）。
1.4.4 脂肪酶活力的測(cè)定（滴定法）
以橄欖油為底物，在一定溫度、pH值等條件下發(fā)生酶促反應(yīng)，以反應(yīng)液中脂肪酸的增加量表示酶活力。脂肪酶活力的定義：在一定的溫度和pH值條件下，每克樣品每分鐘水解產(chǎn)生1μmol游離脂肪酸的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U/g）。
1.5 不同pH值下的酶活
取1%CMC-Na溶液2mL，調(diào)節(jié)pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。加入適當(dāng)稀釋纖維素酶液1mL混勻，在40℃恒溫水浴鍋中催化30min后，加入DNS試劑2mL于沸水浴中顯色5min，冷卻至室溫，測(cè)定吸光度A并計(jì)算酶活。
取2%酪蛋白溶液2mL，調(diào)節(jié)其pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。加入適當(dāng)稀釋酶液1mL混勻，40℃恒溫水浴鍋10min，取出后加入0.4mol/L三氯醋酸2mL終止反應(yīng)。保溫20min，取濾液1mL，再加0.4mol/LNa2CO35mL、福林試劑1mL，搖勻保溫顯色20min后，測(cè)吸光度A并計(jì)算酶活。
配制1.1%的淀粉溶液，調(diào)節(jié)期pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。取適當(dāng)稀釋酶液1mL與1.1%的預(yù)熱淀粉溶液9mL混合，40℃準(zhǔn)確反應(yīng)30min，取反應(yīng)液1mL，迅速與2mL的DNS溶液混合，沸水浴15min，550nm處比色。測(cè)吸光度A并計(jì)算酶活。
取0.025mol/L磷酸緩沖液5mL和聚乙烯醇橄欖油乳化液4mL混合均勻，調(diào)節(jié)其pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。在40℃溫度條件下保溫5min，然后各加入適當(dāng)稀釋的酶液1mL，準(zhǔn)確保溫15min，取出后立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示劑3滴，用0.05mol/L氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止，計(jì)算酶活。
1.6 不同溫度下的酶活
選取適當(dāng)稀釋纖維素酶液1mL與pH5.0的CMC-Na緩沖液2mL混勻，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度條件下恒溫水浴30min，取出后加入DNS試劑2mL于沸水浴中顯色5min，冷卻至室溫。測(cè)定吸光度A計(jì)算酶活。
取2%酪蛋白1mL，調(diào)節(jié)pH至5.0，加入稀釋酶液1mL混勻，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度條件下恒溫水浴10min，取出后加入0.4mol/L三氯醋酸2mL終止反應(yīng)，離心后取濾液1mL，加0.4mol/LNa2CO35mL、福林試劑1mL，搖勻保溫顯色20min后，測(cè)吸光度A并計(jì)算酶活。
配制1.1%的淀粉溶液，調(diào)節(jié)pH至5.0。取適當(dāng)稀釋酶液1mL與1.1%的預(yù)熱淀粉溶液9mL混合，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度條件下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，取反應(yīng)液1mL，迅速與2mL的DNS溶液混合，沸水浴15min，550nm處比色。測(cè)吸光度A并計(jì)算酶活。
取0.025mol/L磷酸緩沖液5mL和聚乙烯醇橄欖油乳化液4mL混合，調(diào)節(jié)pH至5.0，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的溫度條件下保溫5min，然后各加入適當(dāng)稀釋的酶液1mL，準(zhǔn)確保溫15min，取出后立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示劑3滴，用0.05mol/L氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止，計(jì)算酶活。
2 結(jié)果與分析
2.1 pH值對(duì)復(fù)合酶酶促反應(yīng)的影響
pH值的改變會(huì)明顯改變纖維素酶的催化能力。設(shè)定酶促反應(yīng)溫度40℃，考察pH值變化對(duì)酶促反應(yīng)的影響。由表1可知，纖維素酶催化反應(yīng)最適宜的酸堿度在pH=5.0，偏酸性的反應(yīng)條件接近動(dòng)物腸道酸性環(huán)境，因此，可以作為飼用纖維素酶添加劑在動(dòng)物腸道中繼續(xù)發(fā)揮催化作用。
蛋白酶酶活在pH=6.0時(shí)酶催化能力最強(qiáng)，當(dāng)pH低于或高于6.0都會(huì)影響其催化能力。脂肪酶和淀粉酶在pH為5.0、6.0和7.0時(shí)差別較小，因此，復(fù)合酶酶促反應(yīng)的適宜pH值應(yīng)該在5.0～6.0，pH=5.0時(shí)纖維素酶催化能力較強(qiáng)，pH=6.0時(shí)脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶的催化能力較強(qiáng)。
表1 pH值對(duì)纖維素酶促反應(yīng)影響 U/g·min
| pH值 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 |
| 纖維素酶活 蛋白酶酶活 脂肪酶酶活 淀粉酶酶活 |
7 383 54 14 210 |
7 561 102 17 256 |
12 632 348 37 321 |
6 224 462 40 341 |
4 512 360 38 319 |
2.2 溫度對(duì)復(fù)合酶酶促反應(yīng)的影響
溫度是影響纖維素酶酶促反應(yīng)的重要因素之一。設(shè)定pH=5.0的條件下溫度變化對(duì)酶促反應(yīng)的影響。由表2可知，當(dāng)反應(yīng)體系溫度為60℃時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到14 293U/g；在20℃時(shí)纖維素酶活最低，僅有6 022U/g；隨著溫度的升高，酶活力逐漸增加，但在30℃、40℃和50℃時(shí)，酶活力變化不大，這可能與產(chǎn)酶菌種有關(guān)。Y7-6和S6-5都能夠產(chǎn)生高活力的纖維素酶，由于每個(gè)菌種產(chǎn)生的纖維素酶的性質(zhì)有所不同，因此造成了從30～50℃酶催化能力變化不大。作為飼用酶，40℃的催化條件可以延續(xù)酶在動(dòng)物腸道中的催化作用。因此，如果在飼料預(yù)混時(shí)添加酶制劑，應(yīng)該選擇60℃的溫度，這樣可以減少添加量，增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的催化能力隨著溫度的升高而增加，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度達(dá)到50℃時(shí)蛋白酶的催化能力最高，60℃時(shí)酶活力顯著降低；而脂肪酶和淀粉酶也在50℃時(shí)催化能力最強(qiáng)，但在60℃催化能力下降不明顯。綜合分析各因素，復(fù)合酶酶促反應(yīng)的適宜溫度是50～60℃。
表2 反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶促反應(yīng)的影響 U/g·min
| 溫度/℃ | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 |
| 纖維素酶活 蛋白酶酶活 脂肪酶酶活 淀粉酶酶活 |
6 022 199 16 182 |
10 363 325 29 231 |
10 906 402 42 308 |
12 632 511 45 398 |
14 293 355 37 367 |
3 結(jié)論
飼用復(fù)合酶制劑的主要酶種包括纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶。在探討復(fù)合酶中各種酶的適宜催化條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，纖維素酶催化反應(yīng)最適宜的酸堿度在pH=5.0，當(dāng)反應(yīng)體系溫度為60℃時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到14293U/g；蛋白酶酶活在pH=6.0時(shí)酶催化能力最強(qiáng)，當(dāng)pH低于或高于6.0都會(huì)影響酶的催化能力；脂肪酶和淀粉酶的酶活在pH為5.0、6.0和7.0時(shí)差別較小。
蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的催化能力隨著溫度的升高而增加，當(dāng)反應(yīng)體系的溫度達(dá)到50℃時(shí)蛋白酶的催化能力最高，60℃時(shí)酶活力顯著降低；而脂肪酶和淀粉酶也在50℃時(shí)催化能力最強(qiáng)，但在60℃催化能力下降不明顯。
因此，復(fù)合酶酶促反應(yīng)的適宜pH值應(yīng)該在5.0～6.0，適宜的溫度是50～60℃。
（參考文獻(xiàn)略） 飼料廣角
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