關鍵詞：體外消化；黏度；能量；復合酶制劑
近年來，在家禽日糧中使用非淀粉多糖（NSP）酶已非常普遍，但NSP酶的作用效果受諸多因素的影響，特別是酶譜的組成、活性與日糧中相應底物的匹配性。因此，針對日糧的抗營養特性篩選與之相適應的NSP酶，可以最大限度地利用飼料的有效能值。國內蛋雞飼料配方多為玉米-豆粕-雜粕型，豆粕中含有30.3%的NSP（Smits和Annison，1996），其中70%~90%為細胞壁成分，細胞壁形式的NSP由溶解度、顆粒大小和化學結構各異的分子團組成。小腸內NSP的抗營養作用體現在產生的食糜黏度和抑制被包裹的養分降解上（Bedford，1999）。很多試驗已經表明飼料酶可打開這些高聚物之間的連接而降低其在腸道中造成的黏度，提高飼料養分消化率。試驗證明，黏度是預測酶制劑在肉雞大麥日糧中效果的最佳指標（Rotter等，1989）。研究表明，外源性β-葡聚糖酶可以顯著地提高飼喂大麥型和燕麥型日糧肉雞的生產性能，而對黑麥型日糧的作用效果不明顯，這說明兩種日糧中酶作用的底物差異較大，大麥、燕麥中的NSP以β-葡聚糖為主，而小麥和黑麥中NSP主要為阿拉伯木聚糖（Friesen等，1992）。Choct等（1997）也發現，對小麥、黑麥、小黑麥、大麥、高粱、大米和玉米日糧，雞日糧代謝能值（AME）與其中的阿拉伯木聚糖（R2=-0.95）及NSP（R2=-0.97）含量間存在著較強的負相關性。
現階段酶制劑的應用技術尚不完善，其使用依然存在著隨意性，很多試驗停留在驗證酶制劑的效果上，所得到的試驗結果存在片面性，對復合酶使用效果的評價也存在很多爭議，這些都制約著酶制劑的進一步推廣應用。為了探討復合NSP酶中酶譜的組成與活性同日糧潛在可利用能值的關系，本試驗以胃蛋白酶-胰酶兩步酶水解法為技術手段，以食糜黏度變化為檢測指標，針對蛋雞日糧中NSP的特性，篩選與之適應的酶譜，為NSP酶制劑使用者提供理論參考。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
pH計（PHS-3C）、紫外可見分光光度計（752N）、磁力攪拌器、鼓風干燥箱、恒溫水浴振蕩器、醫用低速離心機（40C）、Brookfield黏度計（DV-Ⅱ+Pro型）、胃蛋白酶（1:2000，Sigma）、胰酶（Sigma）。
1.2 試驗酶制劑
木聚糖酶（3.60×107 U/g）、甘露聚糖酶（7.20×106 U/g）、果膠酶（1.50×106 U/g）。
木聚糖酶活性單位定義為在37℃和pH 5.5條件下，每分鐘從1.0%燕麥木聚糖底物中釋放1μg還原性產物所需要的酶量定義為一個木聚糖酶單位，以U/g表示。
甘露聚糖酶活性單位定義為在37℃和pH 5.5條件下，每分鐘從0.6%甘露聚糖底物中釋放1μg還原性產物所需要的酶量定義為一個甘露聚糖酶單位，以U/g表示。
果膠酶活性單位定義為在37℃和pH 5.5條件下，每分鐘從0.8%果膠底物中釋放1μg還原性產物所需要的酶量定義為一個果膠酶單位，以U/g表示。
1.3 試驗設計
試驗日糧中植物性原料的種類與含量見表1。日糧中木聚糖、甘露聚糖和果膠含量較高。試驗首先在日糧中添加不同梯度木聚糖酶（4、5、6、7、8g/t），通過食糜黏度的變化得到木聚糖酶的適宜添加量；將木聚糖酶適宜添加量確定后，保持木聚糖酶添加量不變，再分別在日糧中添加不同劑量甘露聚糖酶（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/t）；同樣的方法確定甘露聚糖酶最適添加量之后，保持木聚糖酶和甘露聚糖酶最適添加量不變，在日糧中添加不同劑量果膠酶（10、15、20、25、30g/t），通過食糜黏度的變化確定果膠酶的適宜添加量，最終得到蛋雞日糧適宜復合酶制劑組合和活性的含量。
表1 蛋雞日糧中植物性原料種類與含量 %
| 原料名稱 | 含量 |
| 玉 米 豆 粕 棉 粕 菜 粕 |
55 15 8 5 |
1.4 體外消化過程
根據Bedford和Classen（1993）的方法稍作修改。具體操作如下：準確稱取1.25g粉碎（過1mm篩）飼料樣品于三角瓶中，分別加入不同梯度外源酶制劑（木聚糖酶、甘露聚糖酶、果膠酶）后，再加入1mg/mL新鮮胃蛋白酶鹽酸溶液（0.1N，pH=2.0），在40℃恒溫水浴中振蕩，消化時間為2h。胃消化階段結束后，向溶液中加入1mL新鮮胰酶溶液（5mg/mL），調節溶液pH值為6.5（用1M NaOH溶液），于40℃恒溫水浴中振蕩，消化時間為4h。
1.5 檢測指標
體外消化結束后將三角瓶取出，混合物于3 000g離心15min，取上清液用黏度計（Brookfield DV-Ⅱ+ Pro）測定其黏度。黏度變化（%）= 加酶組食糜黏度/對照組食糜黏度×100。
2 結果與討論
2.1 胃蛋白酶-胰酶兩步法體外模擬消化試驗
隨著飼用酶制劑應用越來越深入，準確科學地對飼用酶作用效果進行評估和預測顯得十分重要。通常動物飼養試驗是準確可靠的評定方法，但是由于酶譜篩選試驗較復雜，試驗組較多，因此，用動物飼養試驗法篩選酶譜不僅費時、費力，而且試驗結果變異性較大，不能對飼用酶制劑作出準確評估。體外模擬消化技術評定NSP酶的可行性和其在酶制劑應用研究中的作用已經由試驗得到證明（Graham，1988；Bedford和Classen，1993）。隨著技術進步和單胃動物消化生理的研究進展，單胃動物體外消化技術也得到了很大發展，其中應用最多的是胃蛋白酶-胰酶兩步法，該方法所測得的豬體外養分消化率與體內消化率之間存在較強的相關性，可以用于預測多種飼料蛋白質、干物質、能量等養分的體內消化率。
外源酶制劑除了在飼料加工過程中有損失，還受到消化道內環境的影響（唐茂妍等，2009）。因而體外模擬消化技術通過模擬畜禽消化道內環境參數，可較好反映出外源酶制劑在畜禽消化道內催化反應的條件。有學者成功運用體外消化模擬技術分別對火雞和豬日糧中添加外源酶制劑的作用效果進行了評定和預測（Zyla等，1995；Liu等，1997）。Bedford等（1993）利用離體法準確地預測了酶制劑對肉仔雞小腸食糜黏度和增重的影響。Malathi和Devegowda（2001）利用離體法測定消化產物的黏度和總糖釋放量進行了酶譜篩選。侯小鋒等（2005）利用兩步法準確地對添加酶制劑的肉仔雞日糧生物學效價進行了評定，并獲得了AME（Y，MJ/kg）與IVDE（X，MJ/kg）的回歸方程：Y＝0.824 2X+2.365 4（r＝0.884 6）。以上諸多試驗結果均證明了離體法在酶譜篩選工作中的可行性。
本試驗采用胃蛋白酶-胰酶兩步法體外模擬了消化道生理參數，包括pH值、消化液濃度、消化酶種類和濃度等條件。試驗表明，隨著木聚糖酶添加量增加飼料黏度逐漸降低。木聚糖酶添加量為6.0g/t時，飼料黏度最低，繼續添加木聚糖酶飼料黏度下降不顯著。與木聚糖酶相似，飼料黏度隨甘露聚糖酶添加量的增加而顯著降低，但其添加量達到一定程度時（1.5g/t），酶添加量再增加，飼料黏度下降較小。同樣，果膠酶添加量為25g/t時，飼料黏度最低（表2）。
表2 木聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶最適添加量
| 木聚糖酶添加量/（g/t） | 黏度變化/% | 甘露聚糖酶添加量/（g/t） | 黏度變化/% | 果膠酶添加量/（g/t） | 黏度變化/% |
| 0.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 |
100.00 99.25 98.50 98.12 97.74 97.74 |
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 |
100.00 99.24 99.24 98.48 98.48 98.48 |
0.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 |
100.00 99.37 98.77 98.32 97.87 97.90 |
2.2 單項酶制劑與復合酶制劑對飼料黏度的效果比較
不同組合酶制劑對飼料的作用效果有顯著差異。以飼料黏度為檢測指標，飼料中單獨添加木聚糖酶或甘露聚糖酶，飼料黏度降低程度遠遠低于木聚糖酶+甘露聚糖酶和木聚糖酶+甘露聚糖酶+果膠酶這兩種組合酶（圖1）。
動物日糧中由于原料的組成和含量不同，導致其中NSP的組成和含量也不盡相同，其所需要的NSP酶組成和活性也不同。Malathi和Devegowda（2001）研究表明，因豆粕中富含果膠，在含豆粕高的日糧中添加木聚糖酶、纖維素酶和果膠酶的效果比只添加木聚糖酶和纖維素酶的效果更好。所以，只有根據日糧中NSP的組成和含量，添加相應的NSP酶種類，才能充分挖掘出日糧的營養價值。但是，目前生產中所使用的NSP酶大多標識為“通用復合酶”，其酶譜組合缺乏日糧針對性。因此，在肉雞（侯小鋒，2005）、蛋雞（趙敏，2006）日糧離體消化能評定方法研究取得成功的基礎上，本試驗以胃蛋白酶-胰酶兩步酶水解法為手段，以食糜黏度變化為評估指標，針對蛋雞日糧中NSP的特性，篩選與之適應的酶譜，木聚糖酶、甘露聚糖酶和果膠酶的最適添加量分別為6.0、1.5和25g/t。
圖1 不同組合酶制劑對飼料黏度的影響
由于酶制劑的影響因素很多（王繼強等，2004），因此，本試驗并不能完全證明體外酶解能力的高低與酶制劑在實際生產上的應用效果一致。對于體外酶解試驗結果必須結合動物飼養試驗才能進行全面的評估，但體外酶解試驗結果為酶制劑使用者在篩選時提供了很好的參考。
（參考文獻略）
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