1 前言
青貯飼料是把青飼料切碎，裝入青貯塔或青貯窖內密封，經過微生物發酵而制成的一種耐貯存和適口性好的飼料，是反芻動物最重要的粗飼料來源之一。玉米青貯的質量直接影響到反芻動物的生產性能及生產者的經濟效益，而青貯飼料質量的好壞又同它所含有的乳酸菌有很大的關系。乳酸菌是在工業上有重要意義的一類微生物，在輕工、食品、醫藥及飼料工業等許多行業都有廣泛的應用。從越來越多相關領域的研究中也可以反映出乳酸菌的重要性，而且很多國家的政府和企業都已經意識到了乳酸菌的經濟意義。歐盟委員會和一些商業機構已經對乳酸菌的長期研究和利用進行了大量的資金投入。乳酸菌在飼料工業中起著重要的作用，尤其是在青貯飼料制備這一領域，已經有很多國家如歐盟國家和美國的研究者對乳酸菌在青貯飼料制備中的應用進行了大量深入的研究。研究內容包括性狀優良乳酸菌的篩選，主要有腸球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、鏈球菌和乳桿菌等（Cai Yimin等，1999）；乳酸菌對青貯飼料發酵品質的影響；添加乳酸菌的青貯飼料對奶牛采食量的影響以及乳酸菌對青貯飼料二次發酵的抑制作用等（Weinberg等，1999）。我國在青貯添加劑技術的研究與應用方面十分薄弱，迫切需要加強。發酵促進型乳酸菌添加劑在玉米秸稈青貯飼料中的研究報道很少見，生產實踐應用的添加劑大多是營養型添加劑。因此，針對我國的具體情況，開展這一領域的研究十分必要。
本研究的目的是從自然發酵的優質青貯飼料樣品中分離乳酸菌，對其進行鑒定，并從中篩選出性狀優良的乳酸菌，為制備優良的青貯飼料專用發酵劑奠定基礎。
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 樣品來源
從黑龍江省共12處農場和畜牧公司的青貯窖中采集樣品。
2.1.2 標準菌株
瑞士乳桿菌（L.casei），代號為ATCC15009；嗜酸乳桿菌（L.acidophilus），代號為ATCC4356；乳酸乳球菌乳酸亞種（Lc.lactis subsp.lactis），代號為ATCC19435。
2.1.3 儀器設備
光學顯微鏡（OLMPUS）、梅特勒-托利多Delta320pH計、電熱手提式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、超凈工作臺。
2.1.4 各種培養基與試劑
運動性試驗、明膠液化試驗、七葉苷水解試驗的培養基以及MRS培養基均是根據凌代文（1999）介紹的方法配制；吲哚試驗培養基是按照中國科學院微生物研究所細菌分類組（1978）介紹的方法配制；H2S產生試驗、硝酸鹽還原試驗以及各種碳水化合物水解試驗的培養基均是購于浙江省杭州天和微生物試劑有限公司生產的細菌微量生化反應管；各種生化試劑和染色液均是按照文獻（凌代文，1999；杜連祥等，1992）的方法配制。
2.2 方法
2.2.1 樣品的制備
用四分法均勻采取優質的青貯樣品200g左右于密封袋中，并封好放入冰盒內，帶回實驗室于4℃冰箱中保存備用。
2.2.2 乳酸菌的分離與純化
在無菌室中稱取1～12號青貯飼料樣品各10g，分別置于裝有15ml滅菌生理鹽水的大試管中浸泡2h，然后用生理鹽水適當稀釋，選3個稀釋度，每個稀釋度取0.1ml分別涂布SL和M17平板，在37℃下培養24～72h，然后挑取典型菌落，進行革蘭氏染色、鏡檢。凡是革蘭氏陽性的菌株，繼續分離純化培養，純化后的菌株接種到MRS斜面培養基培養后，置4℃冰箱中保存備用。
2.2.3 乳酸菌屬的鑒定試驗
根據文獻（凌代文，1999；中國科學院微生物研究所細菌分類組，1978；杜連祥，1992；敖敦格日勒，2001a、2001b；賀銀鳳，2002）介紹，凡是革蘭氏陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌，然后進行乳酸菌屬的鑒定試驗。乳酸桿菌屬的確定需要做硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、H2S產生試驗及pH值4.5的生長試驗。乳酸球菌的鑒定還需做溫度試驗、耐鹽性試驗、葡萄糖產氣試驗等來區分腸球菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬。
2.2.4 乳酸菌種的鑒定試驗
根據文獻（凌代文，1999；中國科學院微生物研究所細菌分類組，1978；杜連祥等，1992）介紹，乳酸菌種的鑒定主要是根據供試菌株對碳水化合物的發酵產酸試驗，即通過對單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區分。
2.2.5 用于制作青貯飼料發酵劑的優良乳酸菌篩選試驗
將分離并鑒定的17株乳酸菌分別按3%的接種量傳入MRS液體培養基中，37℃恒溫培養。每隔2h測定不同菌株發酵液pH值，繪制的產酸速率曲線是不同發酵時間（h）所對應發酵液pH值的變化。根據不同菌株的產酸能力以及產酸速率來篩選適宜用作青貯飼料的菌株。
3 結果與討論
3.1 乳酸桿菌屬種的鑒定結果
有21株菌被確定為乳酸桿菌屬，它們都能在15℃和45℃條件下生長。其中Ssd3、Ssd1-1都能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖、果糖、甘露糖、松三糖、水楊苷產酸，不能利用蜜二糖、棉籽糖、阿拉伯糖、山梨醇產酸，不能水解七葉苷，與玉米乳桿菌的性質相近，但二者能利用木糖產酸（酸性較弱），與模式菌株有差別。Ssd2-1、Ssd2-3、Sld1-2、Sld2-1異型發酵，都能利用葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、蜜二糖、松三糖產酸，不能利用纖維二糖、甘露糖、山梨醇、水楊苷產酸，與布氏乳桿菌的性質相近，但Ssd2-1、Sld1-2不能利用麥芽糖產酸，與模式菌株有差別。Slm1-3能利用葡萄糖、甘露醇、纖維二糖、半乳糖、果糖、甘露糖、松三糖、山梨醇產酸，不能利用蜜二糖、棉籽糖產酸，能水解七葉苷，與干酪乳桿菌的發酵性質相近，但其能利用木糖、阿拉伯糖產酸（酸性較弱），與模式菌株有差別。Stj1-1、Stj2-1、Shw3-3、Shw3-6異型發酵，能發酵葡萄糖、果糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖產酸，不能利用纖維二糖、甘露糖、松三糖、山梨醇產酸，與短乳桿菌的性質相似。Shj1-3、Shj1-4、Sks3-5都能利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、麥芽糖、纖維二糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蜜二糖、山梨醇產酸，能水解七葉苷，與戊糖乳桿菌的性質相近，但3株菌都不能利用棉籽糖產酸，與模式菌株有差別。Sld3、Sfq2-2、Sfq3-1、Sfq3-3、Shw4-1、Shj1-1、Shj1-5還無法確定它們屬于哪個種。在分離菌株中Ssd3、Ssd1-1能利用木糖產酸，Slm1-3能利用木糖、阿拉伯糖產酸，與模式菌株有差異，這可能是由于分離菌株長時間生長于青貯飼料中，已經適應于青貯飼料的生長環境，而木糖和阿拉伯糖則廣泛地存在于許多植物中，從而能利用木糖或阿拉伯糖產酸。
3.2 乳酸球菌屬種的鑒定結果
在本研究中共分離得到4株球菌，鑒定結果見表2。
有3株被確定為腸球菌，1株為片球菌屬。其中Slm1-5，Ssm3-1，Shw3-7能在10℃、45℃溫度下生長，耐6.5% NaCl，被確定為腸球菌屬。Slm1-5，Ssm3-1不能利用甘露醇、木糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、松三糖、山梨醇、山梨糖產酸，與堅強腸球菌的性質相似；Shw3-7能利用乳糖、甘露醇、松三糖、山梨醇產酸，不能利用木糖、蜜二糖、棉籽糖產酸，與糞腸球菌的性質相似。Slm3-4的細胞呈四聯狀排列，在對各種碳水化合物的發酵試驗中，只能利用單糖（葡萄糖、果糖、甘露糖）產酸，不能利用山梨醇和淀粉，而且不能從葡萄糖產氣，確定為片球菌屬，但不能確定其屬于哪個種。
由于在自然發酵的青貯飼料中，乳酸菌的種類和菌數都很少，而且在發酵成熟的青貯飼料中的主要是乳桿菌，存在的乳酸球菌非常少（Lin，1992）。因此，本研究從12種不同來源的青貯飼料中僅分離得到5種乳酸桿菌，2種乳酸球菌。
3.3 產酸速率測定結果
如圖1、圖2所示，球菌中Ssm3-1和Shw3-7菌株產酸性能較好，其中Ssm3-1菌株的產酸能力最強，10h左右pH值就能達到3.6。桿菌中Ssd3和Sld2-1菌株的產酸性能較好，14h左右就能達到很低的酸度，尤其是Ssd3菌株的產酸能力非常強，14h左右pH值能夠降低到3.22。產酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一，不同菌株間存在較大的差異。在青貯飼料制備過程中pH值的快速并且大幅度的降低能夠顯著抑制青貯玉米原料中的那些對青貯飼料品質有不良影響的微生物，如丁酸菌、絲狀真菌、酵母及霉菌的生長，從而提高青貯飼料的品質。因此球菌Ssm3-1和Shw3-7，桿菌Ssd3和Sld2-1，可被用來制作優良的玉米青貯發酵劑。
4 結論
4.1 本研究從12種不同來源的青貯飼料中分離到25株乳酸菌，將其中的17株鑒定到種：玉米乳桿菌2株、布氏乳桿菌4株、短乳桿菌4株、戊糖乳桿菌3株、干酪乳桿菌1株、糞腸球菌1株、堅強腸球菌2株。
4.2 從已鑒定的乳酸菌中，篩選出了產酸性能較好的球菌Ssm3-1和Shw3-7菌株、桿菌Ssd3和Sld2-1菌株。在MRS液體培養基中，球菌Ssm3-1和桿菌Ssd3產酸速度很快，球菌Ssm3-1，10h的pH值達3.6；桿菌Ssd3，14h的pH值達3.22。可用來制作青貯飼料發酵劑。（劉 飛 楊麗杰 侯俊財 國立東 霍貴成）
