我國蛋品工業發展迅速，但蛋殼利用率卻很低[1]。目前，我國對蛋殼垃圾的處理主要是粉碎之后用作動物的補鈣飼料，而大部分企業則直接將其置于環境中，造成蛋殼大量堆積，且這些蛋殼中殘留的蛋清及蛋殼膜會很快腐敗變質，不僅污染環境，也造成蛋殼資源的浪費[2-3]。因此，蛋殼資源的開發利用已成為我國蛋品加工業亟待解決的一項重要問題。已有科技工作者通過煅燒法和直接反應法等方法將蛋殼中的碳酸鈣轉化為有機酸鈣，但普通鈣質在人體內利用率很低，而生物活性鈣劑采用特殊工藝處理，使之成為易被人體消化、吸收和利用的活性鈣，產品呈白色粉末狀，無味，可作為天然食品強化劑，適用于烘焙產品、酸性飲料中，也可應用于各種口味的方便調料中[4-5]。因此，選擇雞蛋殼為原料進行食品級鈣螯合物的制備工藝研究，以期達到對雞蛋殼資源化利用的目的。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料

　　新鮮雞蛋殼；胃蛋白酶（活力單位1.25萬U/g），購于諾奧酶制劑生物有限公司；供試菌：植物乳桿菌（Llactobacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），由中國農業大學微生物實驗室提供。

　　1.2供試試劑

　　檸檬酸鈉溶液；NaOH溶液；HCl溶液；鈣指示劑和鈣標準溶液；EDTA標準溶液；硫酸、高氯酸、硝酸消化液；15%硫酸溶液。試劑均為分析純，由北方天醫化學試劑有限公司提供。

　　1.3試驗方法

　　1.3.1蛋殼酶解鈣溶液的制備。制備流程：新鮮蛋殼→粉碎→酶解→離心→冷凍干燥→灰化→測鈣。其中粉碎、酶解、離心的具體步驟如下：①粉碎：雞蛋殼在55 ℃烘干，用研缽粉碎，過800目篩3次；②酶解：選用胃蛋白酶，酶解時間分別為3、4、5 h，底物濃度分別為1∶2、1∶2.5、1∶3，添加量分別為1 800、2 000、2 200 U/g，酶解溫度37 ℃，最適pH值3.0（酶解過程中不斷加入1 mol/L氫氧化鈉溶液和6 mol/L鹽酸溶液調節pH值）；③離心：酶解結束后，90 ℃滅酶10 min；待溫度降至室溫后，90 g離心10 min，取上清液裝入滅菌的玻璃容器。

　　1.3.2發酵劑的制備。①菌種活化：將植物乳桿菌、戊糖片球菌（活化溫度均為37 ℃）、嗜熱乳酸鏈球菌、丁二酮乳酸鏈球菌和嗜酸乳桿菌（活化溫度均為39 ℃），按1%接種量分別接入經121 ℃、15 min滅菌的液體MRS培養基中，活化3代后菌數達到107～108 cfu/mL即可。②菌種傳代（3 d）：挑菌種于10 mL液體培養基，37 ℃培養24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液體培養基中，培養24 h后，再吸取100 μL，放入10 mL液體培養基中（第3代）。③菌數測定（1 d）：用傾注平板法測定活化3代后的菌種菌數。④菌種馴化：試驗采用在液體MRS培養基中逐步增加酶解液含量，具體比例按表1進行，使乳酸菌逐漸適應以酶解液作為培養基的生長環境。

　　按表1比例混合后，將2個菌種分別接種于1號培養基，置37 ℃恒溫搖床培養，每隔5 h觀察1次培養狀態。馴化過程中，每馴化1個梯度時，反復馴化2～3次。如果在9～10 h內，培養基出現明顯渾濁，且菌落總數達到107～108 cfu/mL，則將其轉接到下一比例的培養基中繼續馴化。⑤高溫滅菌：將蛋殼酶解溶液、（MRS）培養基、槍頭、離心管、玻璃瓶、玻璃棒在121 ℃滅菌15 min。

　　1.3.3鈣含量測定――EDTA法（GB12398-90）。①樣品處理：取2 mL的樣品干法灰化后，加入1∶4鹽酸5 mL，置于水浴上蒸干，再加入1∶4鹽酸溶解并移入25 mL容量瓶中，用熱無離子水（70～80 ℃）多次洗滌灰化容器，洗滌水并入容量瓶，冷卻后用無離子水定容。②測定方法：取5 mL經前處理后的樣品，加水15 mL，加入0.05 mol/L檸檬酸鈉2 mL、2 mol/L氫氧化鈉2 mL、鈣指示劑5滴，用EDTA溶液滴定至純藍色，記錄EDTA消耗量。以蒸餾水代替樣品做空白試驗。再利用下式計算出鈣含量。

　　總鈣（mg/100 g）=■×100

　　式中：T―1 mL EDTA標準溶液相當于鈣的毫克數；V―滴定樣液消耗EDTA溶液體積（mL）；V0―滴定空白消耗EDTA溶液體積（mL）；V1―測定時取樣體積（mL）；V2―蛋殼酶解樣液定容的總體積（mL）；V3―稱取蛋殼酶解樣液體積（mL）。

　　1.4試驗設計

　　1.4.1胃蛋白酶酶解蛋殼正交試驗設計。根據試驗因素水平選取3因素3水平編碼表，選取L9（34）正交表作為試驗方案（表2）。

　　1.4.2蛋殼酶解液菌種發酵試驗設計。發酵條件：將酶解液用植物乳桿菌和戊糖片球菌（1∶1）在37 ℃下進一步發酵，接菌量8.7%，發酵時間19 h，葡萄糖添加量3.93%。發酵液濃度為0.2 kg/L。發酵步驟：每隔6 h取30 mL發酵液（混和均勻），測定其鈣含量和pH值，如果24 h內鈣含量有下降趨勢，用6 mol/L HCl調解pH值降至3，溫度升高到37 ℃，終止發酵。

　　2結果與分析

　　2.1正交試驗的直觀分析（極差分析）

　　根據極差R的大小進行因素的主次排隊，可以看出各因素的重要性：酶解時間（A）＞底物濃度（B）＞酶用量（C）。且因素A、B、C的R值都大于空列的R值（表3）。因此，此次試驗沒有不重要因素的存在。

　　由圖1可知，各因素最優的水平組合為：A2B3C2，與試驗結果第5組最優矛盾，故還需進行驗證試驗。經驗證試驗測得A2B3C2鈣含量為4 648 mg/100 g，小于試驗所得值4 672 mg/100 g，故試驗最優組合為第5組，即酶解時間為4h、加水量為12.5 mL（即底物濃度為1∶2.5）、酶用量為0.055 g（2 200 U/g）。因此，試驗最佳酶解條件確定為pH值3，酶解溫度37 ℃，酶解時間4 h，酶用量為0.055 g（2 200 U/g）、加水量為12.5 mL（底物濃度為1∶2.5）。

　　2.2酶解發酵后樣液中鈣的含量

　　采用EDTA滴定法測定樣液中鈣的含量，具體步驟如下：分別取樣品0.968 7、0.973 2、0.699 8 g，配制成酶解樣液，均取5 mL于250 mL容量瓶中，而后定容待測。用EDTA滴定樣液，分別消耗EDTA溶液體積25.13、24.70、24.93 mL，空白樣消耗EDTA 0.28 mL。通過計算各組樣液中鈣含量分別為4 912、4 894、4 957 mg/100 g，平均為4 921 mg/100 g?？梢姡捎米顑炈浇M合酶解，在此基礎上經過發酵處理，每100 g蛋殼中獲得4 921 mg鈣。

　　3結論與討論

　　試驗利用酶解和發酵聯用技術，研究了提高蛋殼中鈣的生物利用率的最佳工藝條件，以提高蛋殼中鈣的轉化率。由試驗可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌1∶1混合后發酵胃蛋白酶酶解后的蛋殼酶解原液，發酵液中鈣含量高于原酶解液，100 g蛋殼經酶解發酵可得4 921 mg鈣，經過酶解方法處理只能得到4 672 mg鈣，相比只用酶解的方法，酶解發酵方法對蛋殼鈣轉化率有影響，但影響不顯著，而在實際生產中使用酶解方法比酶解發酵的方法簡便、經濟，故實際生產生活中應采用酶解的方法處理蛋殼，進行批量生產[6]。

　　本文摘自中國論文網，原文地址：http://www.xzbu.com/8/view-1056674.htm